移植物抗腫瘤效應抗大腸癌的實驗研究

張曉川 唐樹堯 李吉友 陳志男 侯利民 葉振宇

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移植物抗腫瘤效應抗大腸癌的實驗研究

張曉川 唐樹堯 李吉友 陳志男 侯利民 葉振宇

目的 通過移植物抗腫瘤效應和相關的細胞因子共同作用，建立一套綜合的大腸癌輔助治療方案。方法 對BALB/C小鼠的皮下注射CT26腫瘤細胞來建立結腸癌小鼠模型，將CT26腫瘤模型鼠隨機分組治療，記錄它們的存活天數、腫瘤大小、腫瘤生長抑制率。結果 免疫細胞移植聯合環磷酰胺(CP)治療組的存活天數為(34.9±2.75)天，未治療組存活天數(15.4±2.50)天(P<0.01)。聯合治療組腫瘤抑制率為94.3%。單獨的CP治療組和免疫細胞移植組腫瘤抑制率分別為99.4%和74.4%。結論 免疫細胞移植存在(GVT)效應，有益于腫瘤的治療，是潛在的細胞免疫治療實體瘤的新方法。

移植物抗腫瘤效應(GVT)；大腸癌；同種異基因脾免疫細胞輸注移植(DLI)；環磷酰胺(CP)

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:875～878)

大腸癌是1種常見的嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，腫瘤免疫學各種學說的提出，使其成為新的研究熱點[1]。近幾年，利用激活免疫系統，打破原有的免疫耐受的機理來抗腫瘤的作用已經被廣泛應用在臨床中，例如乳腺癌[2]。現有的腫瘤靶向的免疫治療被認為是較為安全和有效的手段，并且可以彌補長期放化療對患者免疫系統的損傷[3]。利用自體淋巴細胞的移植，目前被認為可能對腫瘤治療有效。然而，由于體外增殖，取材的困難，加之患者的免疫耐受和細胞傳代中的污染等多方面問題可能導致腫瘤的復發，因此在臨床中較少應用[4]。目前，關于免疫細胞移植(DLI)的異基因細胞免疫方面的研究正在迅速發展。異基因移植所引起的細胞免疫彌補了傳統腫瘤免疫過程中副損傷大的缺點，并且提供了較強的的腫瘤殺傷力[5]。本實驗中，我們用脾細胞作為供體免疫細胞。因為脾中含有大量淋巴細胞和少量造血干細胞，并且是天然的免疫器官。與其他移植相比，脾細胞移植有著操控性強，步驟簡化，供者及受者并發癥少的優點。因此，脾細胞誘導GVT有著較好的前景。

1 材料與方法

1.1 動物材料

受體小鼠32只(雌性)，供體鼠10只(雄性)，選自同種系BALB/C鼠，平均年齡8～10周，平均體重18～22克(哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供)。 CT26結腸癌細胞(CRL-2638)由上海傅孟基因生物技術公司購買。CT26腫瘤細胞在含有10%牛胚血清的RPMI-1640培養液中，并在37°C溫箱中培養使其達到指數增生期。牛胎血清補體滅活。

1.2 脾細胞懸液的制備和移植

1.2.1 制備懸液 供體近交系BALB/c(H2d)小鼠采用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔內注射麻醉，無菌條件切取脾臟置于10%肝素鈉鹽水溶液中，將脾臟組織反復剪切后經200目鋼網濾過，濾過液加入5 ml淋巴細胞分離液，離心15 min，吸取中層液體加入1640培養液5 ml漂洗一次，再次加入1640培養液5 ml，即為脾細胞懸液。

1.2.2 細胞計數 吸取稀釋后的細胞懸液，滴加在計數板上，讓其自然流入計數池內，靜止2 min，在顯微鏡下計數。細胞總數(個/ml)=四大格細胞總數÷4×10000×稀釋倍數，根據計算結果將細胞懸液稀釋為(1.5～2.0)×107/ml。

1.2.3 鑒別細胞活力的方法 吸取0.5 ml細胞懸液,滴加0.4%胎盼藍染液0.5 ml,混勻染色2 min，吸取1滴顯微鏡下觀察，藍染者為死亡細胞。隨機選取7～10個視野，計數1 000個細胞，得出活細胞的比例。

1.2.4 脾細胞移植 移植前3周將供體小鼠的脾細胞懸液1 ml[細胞總數為(1.0～2.0)×107/ml;細胞活力≥95%]經尾靜脈輸注到受體小鼠體內。接受脾細胞移植的小鼠出現皮膚紅斑、脫毛、腹瀉、體重減輕時，判為移植物抗宿主反應。

1.3 小鼠大腸癌模型的建立

用1.25 g/L胰蛋白酶溶液收獲處于指數生長期CT-26細胞,吹打成單細胞懸液,用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌并重懸.用臺盼藍(trypan blue)清除試驗鑒定,具有90%以上活力的單細胞懸液用于下一步實驗，各組小鼠右側腋窩皮下接種1×106個CT-26小鼠大腸腺癌細胞，接種腫瘤細胞以后觀察各組小鼠的生存時間,監測小鼠腫瘤體積變化。

1.4 實驗分組情況

用1.25 g/L胰蛋白酶處理CT26腫瘤細胞，并且臺酚藍染色，濾過壞死細胞，制成90%以上存活率的單細胞懸液。在每組小鼠右側的腋下皮下注射CT26腫瘤細胞。觀察小鼠的存活天數，腫瘤大小和體格情況。

雌性BALB/C系鼠，在第3、14、21、28天經尾靜脈輸注脾細胞。

接種CT26腫瘤細胞小鼠被隨機分為4組，每組8只A組(不加治療對照組)：小鼠注射CT-26大腸癌細胞株+生理鹽水注射；B組(環磷酰胺化療組)：小鼠注射CT-26 大腸癌細胞株+腹腔注射100 mg/kg環磷酰胺(CP)；C組(DLI治療組)：同種異基因脾細胞輸注+3周后小鼠注射CT-26 大腸癌細胞株+同種異基因脾細胞輸注；D組(聯合治療組：DLI+CP)：同種異基因脾細胞輸注+3周后小鼠注射CT-26大腸癌細胞株+同種異基因脾細胞輸注+環磷酰胺注射。

1.5 病理學檢查

實驗組取特定時間處死的小鼠，取皮下腫瘤組織病理切片，取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等幾個主要步驟,并放大1000倍，進行移植物抗宿主病病理分級并計算抑瘤率。

1.6 數據采集

存活天數為CT26癌細胞接種至死亡的天數。腫瘤抑制率為主要的評估腫瘤生長的方法，每天測量腫瘤的長短徑。 腫瘤大小=長徑×短徑；腫瘤生長抑制=(未治療組腫瘤大小-治療組腫瘤大小)-未治療組腫瘤大小×100%。

1.7 統計分析

2 結果

2.1 腫瘤模型和生存狀況

接種CT26大腸癌細胞后3～5天的小鼠，腫瘤開始明顯生長，在光鏡下進行觀察,放大1000倍。

由表1可見，A組生存天數最短(15.4±2.50)d，B組為(25.5±4.00)d，C組為(19.4±3.42)d，說明CP和DLI對C726腫瘤有作用。D組存活天數最長(34.9±2.75)d，說明CP和DLI聯合治療的有效性。

B組和D組腹腔注射CP后，出現明顯的體重減輕、脫毛、行動遲緩等癥狀，C組和D組中應用DLI的小鼠出現皮膚干皺、活動遲緩，并在治療過程中逐漸惡化。然而沒有因移植排斥反應而死亡的個體。

表1 不同組別小鼠的生存狀況

注：a為與A組比較，P<0.01；b為與B組比較，P<0.01；c為與C組比較，P<0.01。

2.2 腫瘤生長狀況

四組中的腫瘤生長狀況呈現明顯的不同，接種腫瘤細胞3天后，腫瘤開始在右腋下接種部位明顯生長。A組中生長最快，C組中生長最慢。B組和D組中經CP治療后3天腫瘤逐漸變小甚至消失。然而，B組腫瘤在CP停藥后3天開始逐漸長大。D組中腫瘤在停藥后第5天逐漸長大，見表2。

表2 3天后不同組小鼠的腫瘤體積及腫瘤抑制率

注：a為與 A組比較，P<0.01；b為與B組比較，P<0.01；c為與C組比較，P<0.01。

2.3 組織病理學改變

四組小鼠的腫瘤組織中存在不同程度的出血壞死。B組小鼠腫瘤組織中存在明顯的細胞增大。D組小鼠腫瘤組織中淋巴濾泡大量增殖。

3 討論

本實驗中，時間的關鍵點是CT26腫瘤細胞接種后第3天，此時腫瘤的大小可明顯觀察到。因此，不同治療組的治療藥物從第3天開始添加。Zinocher團隊[6]研究發現時間點的選取對免疫性治療和化學治療的治療效果有關鍵性的影響。我們發現第3～5天免疫接種的適當的時機。因此，在第3天化療后進行免疫接種，可以避免小鼠過早死亡。

目前，淋巴細胞的移植仍然局限在實驗階段。盡管有實驗說明移植物對腫瘤有治療效應，但使之應用于臨床還存在很多困難。 Moscovith團隊發現異源的淋巴細胞在原發性淋巴瘤和轉移性乳腺癌中有抗腫瘤作用[7]。此外，移植異源基因誘發GVT抗腫瘤的作用被認為是免疫治療的最有效手段[8]。臨床上已有利用異基因移植治療卵巢癌、前列腺癌、直腸癌，胰腺癌的報道。綜上所述，在實體瘤的研究中，移植物抗腫瘤的效應可能是腫瘤治療的新突破。

應用異源淋巴細胞取代造血干細胞目的是抑制免疫反應。同時保持受體的造血功能。值得注意的是，治療前并未對小鼠進行照射。因為在經照射的小鼠會出現淋巴細胞輸注后的骨髓抑制[9]。

環磷酰胺(CP)是目前應用廣泛的化療藥物[10]。CP主要作用于細胞有絲分裂周期，抑制DNA的合成，因此可以抑制T細胞分化和B細胞產生抗體。T細胞和B細胞對CP高度敏感，然而Th細胞和效應T細胞對CP不敏感。因此，CP主要抑制體液免疫而非細胞免疫。實驗發現對異源脾細胞輸注后的小鼠用CP進行預處理可誘發輕微的免疫耐受。在小鼠的植皮實驗中，由于主要組織相容性復合體(MHC)的差異導致異源物移植和CP聯合治療不能延長小鼠的生存期。因此，這種治療方式只適用于對免疫耐受較差的腫瘤小鼠的生存期的延長。

鑒于Suzuki團隊[11]的研究，CP能殺滅宿主大多數的T細胞。然而小部分T細胞存活并迅速增殖分化。這種T細胞能對CP產生抗性，并分化成記憶性的細胞。在異源物中可能存在不同的組織相容性抗原和不同數量的免疫細胞。所以，對這些細胞的清除是能否誘發移植物耐受的關鍵。研究發現，通過異基因移植聯合CP預處理，再進行大量的異源脾細胞移植可以導致小鼠長期的免疫細胞分離。這種現象可以提高免疫耐受，并且顯著提高生存期[12]。

關于移植物抗腫瘤的機制目前還不是十分清楚，體外實驗發現移植的脾細胞含有大量CD4+T細胞、NK細胞和單核細胞，在這些細胞中，T細胞和NK細胞可能與抗腫瘤作用關系密切。然而，在移植物抗腫瘤的效應中，T細胞存在著副作用[13]。因此，本實驗為以后對T細胞作用以及GVT的機制研究打下了基礎。腫瘤的免疫耐受可能與腫瘤起源于自身正常組織相關。在腫瘤發病過程中，Ⅰ類主要組織相容性復合體(MHC)下調。因此，特異性的細胞毒性T細胞不能被激活。進一步的研究表明對于異基因移植(DLI)的策略十分關鍵，一次性大劑量的植入會引起嚴重的GVHD反應，而小劑量多次的植入被認為能降低GVHD的效應。本實驗認為應首先考慮移植的時機，其次考慮移植的劑量。在CP和DLI聯合治療組中，輸注的BALB/C小鼠的脾細胞為1.0×107個/ml，分別于第3、14、21,28天。CP劑量為100 mg/kg。

DLI聯合CP處理可以誘發特異性的免疫耐受。本實驗中預處理十分重要.。DLI和CP對CT26腫瘤的治療表現為協同的作用，腫瘤得到了明顯的抑制。并且存活期明顯延長。供體的脾細胞有潛在的抗腫瘤作用，移植的脾中含有大量的異源淋巴細胞和少量造血干細胞。此理論可能對實體瘤的治療大有裨益。然而本實驗仍存在明顯不足，比如未能發現治療過程中腫瘤的病理學變化，對具體的機制認識不清等。這也將是我們下一階段的工作方向。

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(編輯：吳小紅)

Study of Graft Versus Tumor Effect for Colorectal Cancer

ZHANGXiaochuan,TANGShuyao,LIJiyou,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150000

Objective To build a comprehensive adjuvant therapy for colorectal cancer through graft versus tumor effect(GVT) and related cell factor.Methods Subcutaneous injection of CT26 tumor cells of BALB/C mice was conducted to establish the mouse model of colorectal cancer The mice model were randomized into different group and recorded survival times,tumor size and tumor growth inhibition rates.Results The group treated by DLI+ CP survived (34.9±2.75) days and the untreated group survived (15.4±2.50) days(P<0.01).The tumor inhibitory rate was 94.3% in DLI+CP group and CP or DLI alone group were 69.4% and 74.4%.Conclusion GVT effect is helpful for the treatment of tumor,it is a new method for the treatment of solid tumor cells in the future.

Graft versus tumor effect(GVT)；Colorectal cancer；Donor lymphocyte infusion(DLI)；Cyclophosphamide (cp)

蘇州市2015年度第九批產業技術創新專項(編號：SYS201552)

150000 哈爾濱醫科大學第一臨床醫學院(張曉川，唐樹堯，李吉友，陳志男，侯利民)；215004 蘇州大學附屬第二醫院(葉振宇)

侯利民

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.06.002

R735.3+4

A

1001-5930(2017)06-0875-04

2016-07-08

2017-03-21)