ICU耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌檢出及同源性分析

盧雯君 李 健 李情操

ICU耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌檢出及同源性分析

盧雯君 李 健 李情操

目的 通過對重癥監護室（ICU）耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的分離率及同源性進行統計分析，評價重癥監護室目前院內感染控制的狀況。方法 采用回顧性分析的方法，對2013年至2015年重癥監護室患者的銅綠假單胞菌的分離結果進行對比性分析；采用腸桿菌基因間重復共有序列PCR（ERIC-PCR）和瓊脂糖凝膠電泳的方法，對ICU 3年間臨床分離的耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌的同源性進行檢測分析。結果 3年間銅綠假單胞菌的檢出率差異無統計學意義（ P＞ 0.05），耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌檢出率雖差異無統計學意義（P＞0.05），但數值有明顯上升趨勢。112株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌經基因分型，主要分為A、B、C、D、E 5型，其中A型66株，B型34株，C型8株，D、E型各2株。結論 ICU耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌檢出率呈上升的趨勢，并呈高度同源性，可能存在科室內的克隆傳播，應該合理化使用抗菌藥物，以減少此類耐藥菌的產生，并采取更有效的措施預防和控制其在院內的傳播。

重癥監護室 銅綠假單胞菌 同源性 院內感染

銅綠假單胞菌（PA）屬于條件致病菌，廣泛存在于醫院環境中，易發生變異和定植［1］，是院內感染常見的致病菌之一。隨著抗菌藥物在臨床的廣泛使用，銅綠假單胞菌在臨床的檢出率逐年增高，其耐藥性也漸增強，特別是多藥耐藥或泛耐藥菌的出現，對臨床防治工作帶來較大困難。重癥監護室（ICU）是醫院收治危重患者的主要科室，患者多患有嚴重的基礎疾病，免疫力低下，加上較多接受侵入性診療如氣管切開、機械通氣、留置導尿等。因此是院內感染高發區域。作者對本院ICU耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌（CRPA）的檢出率及同源性進行統計分析，評價重癥監護室院內感染控制的狀況。現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2013年1月至2015年12月本院ICU住院患者細菌學檢驗標本（痰液、咽拭子、創面分泌物、血液、中段尿等）。2013年分離病原菌782株，其中PA89株；2014年分離病原菌802株，其中PA 95株。2015年分離病原菌812株，其中PA 89 株。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.2 主要儀器與試劑 法國生物梅里埃公司VITEK 2微生物全自動細菌鑒定分析儀（簡稱VITEK 2）及配套卡片；分離培養基哥倫比亞血瓊脂平板和藥敏培養基MH瓊脂平板為法國生物梅里埃公司生產；采用美國Bio-RAD公司生產的全自動熒光定量PCR儀對整合子PCR反應體系進行擴增；采用美國Bio-RAD公司生產的DYCP-31CN電泳儀和GELDOC XR凝膠成像分析系統對擴增產物進行電泳及結果觀察；實驗中使用的Taq酶及配套試劑由日本TaKaRa公司生產，同源性檢測擴增引物ERIC2均由上海生工生物有限公司合成。

1.3 方法 （1）PCR模板制備：采用煮沸法。（2 ）ERIC-PCR反應體系：去離子水9μl，RTaq DNA聚合酶反應體系12.5μl（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP等），反應引物ERIC2 1.5 μl，上述制備的模板2μl，共25μl。（3）ERIC-PCR反應條件：將按上述方法配制的ERIC-PCR反應溶液25μl，放置于PCR儀中，擴增條件為94℃預變性4 min，隨后94℃下變性40 s、再40℃退火1min、接著72℃延伸5min，需運行40個循環，最后在72℃下延伸10min結束。（4）ERICPCR產物電泳及結果判讀：各取5μl上述擴增產物與6×Loading Buffer液1μl混勻，并加入到含溴化乙啶0.4 μg/ml的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時每列均加入1孔DL2000和1Kbp DNA Ladder Marker混合液（1：1比例混合）5μl，作為參照，進行電泳。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠水平放置于凝膠成像分析儀下觀察，根據與Marker的對應位置，具有相同圖譜的視為相同基因型，具有不同圖譜的視為不同。

1.4 統計學處理 采用WHONET5.6軟件和SPSS 18.0統計軟件對臨床菌株的數據資料進行統計分析，菌株分離率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌分離情況比較 3年間銅綠假單胞菌的檢出率差異無統計學意義（P＞0.05），耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌檢出率雖差異無統計學意義（P＞0.05），但數值有明顯上升趨勢，見表1。

表1 2013至2015年ICU銅綠假單胞菌（PA）分離結果比較

2.2 耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌同源性檢測結果 112株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌經ERIC-PCR基因分型，主要分為A、B、C 、D、E 5型，其中A型66株，B型34株，C型8株、D、E型各2株，部分菌株ERIC-PCR分型圖譜見圖1。

圖1 部分實驗菌株ERIC-PCR分型圖譜

3 討論

銅綠假單胞菌為非發酵革蘭陰性桿菌中假單胞菌屬的一種，廣泛存在于自然界及正常人的皮膚、呼吸道和腸道，屬于條件致病菌。該菌具有多種天然和獲得性耐藥機制，耐藥性強、機制復雜，且具有極強的環境適應力，是醫院感染常見的條件致病菌，可導致呼吸道、泌尿道和血流感染等［2］。

銅綠假單胞菌是重癥監護病房常見的致病菌，且多數對臨床常用抗生素敏感性較差，碳青霉烯類抗菌藥物是臨床上常用于治療銅綠假單胞菌感染的抗菌藥物。然而，這種新抗菌藥物耐藥性也在不斷增加［3］。本資料顯示，其數值呈上升的趨勢。有研究［4］表明耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌對其它種類抗菌藥物也呈高耐藥性，危害性極強。其中，ICU患者抗生素的不合理使用也是碳青霉烯類銅綠假單胞菌檢出率增加的主要原因，患者常使用多種抗菌藥物，易引發菌群失調，破壞機體自身免疫屏障，使銅綠假單胞菌成為呼吸道、傷口感染的重要致病菌，同時也易產生耐藥性，其中耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌屬于嚴重耐藥菌。因此，根據藥敏檢測結果合理使用抗菌藥物，加強耐藥菌的監測非常必要。

銅綠假單胞菌因其特殊的生物學特性，常能引起醫院內感染的發生，易在ICU等病區發生克隆傳播并可能引起大規模的流行，因此對其實施及時的監控，盡早發現其流行趨勢非常重要。目前較為常見的流行病學分析方法包括限制性內切酶聯合脈沖場凝膠電泳（PFGE）、ERIC-PCR、隨機多態核苷酸序列（RAPD）等。其中ERIC-PCR技術以成本低、操作簡便、分辨率高和重復性好等特點［5］，應用較為普遍。本資料結果顯示112株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中，主要為A和B兩種基因型，呈高度同源性。表明本次參檢的耐藥菌株在科室內存在克隆傳播。發生克隆傳播的原因除與這些病區收治的患者病情較重和抵抗力低下有關外，還與科室的隔離消毒、無菌操作、侵入性診療等密切相關［6］，因此對于ICU等院感易發的重點科室，日常工作中加強室內空氣消毒，重視醫療器械的消毒，注意醫護人員手衛生，嚴格無菌操作技術，盡量減少侵入性醫療操作次數，增強患者的抵抗力，及時發現并隔離感染患者，這些措施對于預防和減少交叉感染、耐藥菌的傳播和控制院內感染至關重要。

［1］ 郭宇,王歡,張正. 銅綠假單胞菌整合子與其多藥耐藥的相關性分析. 中華醫院感染學雜志,2010,20(1): 6-8.

［2］ 張祎博,倪語星,孫景勇,等. 2010年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測. 中國感染與化療雜志,2012,12(3): 161.

［3］ Hammami S,Boutiba-Ben Boubaker I,Ghozzi R,et al. Nosocomial outbreak of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing VIM-2 metallo-beta lactamase in a kidney transplantation unit. Diagn Pathol,2011,28(6): 106.

［4］ 張娟,葉聰秀,曹開源,等. 耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌金屬β-內酰胺酶基因檢測及其與整合子的關系研究.中國抗生素雜志,2013,38(9): 705-710.

［5］ 孫晶,常軍霞,劉巍.ERIC-PCR與PFGE檢測銅綠假單胞菌同源性的方法學比. 中國抗生素雜志,2013,38(4): 297-302.

［6］ 陳佑明,孫恒彪,張婧. ICU鮑氏不動桿菌耐藥性分析及同源性調查. 中華醫院感染學雜志,2014,24(22): 5477-5479.

Objective To evaluate the current situation of nosocomial infection control in ICU through the analysis of the detach rate and homology of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa which from ICU in our hospital. Methods Contrastively analyzed detach outcome of Pseudomonas aeruginosa of ICU from 2013 to 2015 by retrospective analysis.Homology was analyzed by ERIC-PCR and agarose gelelectrophoresis. Results There was no statistical difference in the detach rate of Pseudomonas aeruginosa in three years（P＞0.05）.Although there was no statistical difference in the detach rate of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa.Its number was increased.The genotypes of 112 carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa were analyzed by ERIC-PCR. Five genotypes could be obtained，A，B，C，D and E，66 isolates were type A，34 isolates were type B，8 isolates were type C，type D and E each of 2 isolates. Conclusion The detach rate of arbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa of ICU shows an upward trend，and there has a high geneotyp homology within these isolates. These strains are likely to be clonally spread in the department. Antimicrobial agents should be used rationally to reduce the emergence of such resistant bacteria，and we should take more effective measures to prevent and control the spread of it in the hospital.

ICU Pseudomonas aeruginosa Homology Nosocomial infection

浙江省自然科學基金項目（LY15H190006）

315040 浙江省寧波市醫療中心李惠利東部醫院