Notch1基因在妊娠期合并高血壓孕婦胎盤組織中的表達及相關(guān)研究

梅麗娜 寧啟鵬 趙 清 吳孝立 杜 英?

Notch1基因在妊娠期合并高血壓孕婦胎盤組織中的表達及相關(guān)研究

梅麗娜 寧啟鵬 趙 清 吳孝立 杜 英?

目的 探討Notch1基因在妊娠期高血壓（妊高癥）、重度子癇前期及正常胎盤組織中的表達水平及其相關(guān)的臨床意義。方法 分別采用免疫組化和熒光實時定量PCR檢測50例妊高癥、30例重度子癇前期及50例正常胎盤組織中Notch1基因的表達情況。結(jié)果 免疫組化檢測Nocth1蛋白在妊高癥組、重度子癇組及正常對照組中的表達率分別為52.0%、43.4%、76%，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；熒光實時定量PCR檢測Notch1基因mRNA含量在妊高癥組、重度子癇組及正常對照組中分別為（4.10±0.57）、（3.07±0.45），（4.88±0.70），組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Notch1基因的低表達與妊娠期高血壓的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

Notch1 妊娠期高血壓 重度子癇前期 熒光實時定量PCR 免疫組化

妊娠期高血壓疾病是妊娠和血壓升高并存的一組疾病，發(fā)生率為5%～12%。該組疾病嚴重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒病死率升高的主要原因。隨著二胎政策的開放，越來越多的孕產(chǎn)婦面臨著妊娠高血壓帶來的風(fēng)險［1-2］。研究表明，妊娠期高血壓是由廣泛血管內(nèi)皮損傷，血管內(nèi)活性物質(zhì)失衡引起的嚴重病理生理改變［3］。而近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號通路異常表達可引起組織細胞發(fā)育異常，可影響血管的生成和“重鑄”，甚至在早期胚胎發(fā)育及胎盤的血管形成中也占有重要的作用［4-5］。因此妊娠期高血壓的發(fā)生與Notch信號通路密切相關(guān)。作者通過免疫組化與RTPCR技術(shù)檢測Notch1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同胎盤組織中的表達情況，結(jié)合相關(guān)的臨床病理資料，進一步探討與妊娠期高血壓發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2012年11月至2014年2月本院妊高癥及重度子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織80例，妊娠期高血壓及重度子癇前期診斷及分類標準參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》診斷標準。選擇同期無妊娠合并癥擇期剖宮產(chǎn)分娩產(chǎn)婦胎盤組織50例為對照組，年齡22～41歲，平均28.9歲。孕周26～42周。所有孕婦均無糖尿病、心臟病、腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、慢性腎病等相關(guān)病史，孕期無特殊用藥史。

1.2 方法 （1）標本采集：所有標本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。患者剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出后，立即在胎盤母體面正中近臍帶處取約250～500mg的組織，避開出血、壞死組織及鈣化部位，立即置入液氮浸沒以便迅速降溫，液氮運輸。（2）提取：Total總 RNA的提取按R mirVana-RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556的試劑盒進行操作）。（3）頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物及熒光探針引物設(shè)計與合成 數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列（NM_017617），引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計并合成；DEPC由美國Sigma公司生產(chǎn)。在共焦顯微拉曼光譜儀（Renishaw 1000）上檢測熒光。逆轉(zhuǎn)錄過程嚴格按照試劑盒進行（由Invitrogen提供）。上游引物為：TCCAGCAGTCTCCGTCCGTG，下游引物為：GGACCCGCCCACAGTGAAAT。（4）特異mRNA的熒光定量PCR技術(shù)的建立及優(yōu)化熒光PCR：采用ABI Vii7 real-time PCR system實時檢測熒光強度的變化。PCR反應(yīng)體系：H2O 6.4μl，KAPA SYBR FAST Qpcr Master Mix（2×）8μl，Primer（up10pM/μl）0.2μl，Primer（down10pM/μl）0.2μl，Template（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即cDNA）1μl，ROX0.2μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min，94℃變性 8s，60℃ 退火10s，72℃ 延伸45s，循環(huán)55次，最后72℃ 終末延伸10min，4℃保存后再分析結(jié)果。擴增完畢后根據(jù)熒光曲線計算相對比值。（5）癌組織及正常組織mRNA的檢測：在共焦顯微拉曼光譜儀（Renishaw21000）上檢測熒光。激發(fā)光源為氬離子激光器的488nm線，檢測方式是背反式。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，采用F和t檢驗，計數(shù)資料用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 Notch1蛋白在不同胎盤組織中的表達情況見圖1。Notch1蛋白在不同胎盤組織中的強陽性表達率。見表1。

圖1 Notch1蛋白在不同胎盤組織中的表達

表1 三組Notch1免疫組化表達率（n）

2.2 實時定量PCR結(jié)果 總RNA提取經(jīng)電泳掃描分析可見清晰完整的兩條條帶，所提取的RNA符合實驗要求。根據(jù)內(nèi)參，建立Notch1的標準曲線。Notch1基因在妊娠期高血壓組胎盤組織、重度子癇前期組胎盤組織和正常對照組胎盤組織中的表達情況見表2。

表2 Notch1 mRNA在三組胎盤組織中的表達（x±s）

3 討論

Notch基因首次發(fā)現(xiàn)于1917年，其突變能造成果蠅的殘翅，1983年Artavanis Tsakonas研究組完善相關(guān)研究并首次克隆了該基因［4］。Notch信號通路在進化上相對保守，其家族的受體和配體通過局部細胞間的相互作用來調(diào)節(jié)無脊椎和脊椎動物個體的發(fā)育［5-6］。目前大量實驗研究證實Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)細胞發(fā)育、胚胎發(fā)育、T細胞形成、維持造血干細胞的自我更新、腫瘤細胞形成及血管生成中均起著重要作用，其中尤以腫瘤細胞形成和血管生成方面研究較多［7-8］。Notch信號在血管的發(fā)生發(fā)展，包括細胞增殖、分化、遷移，平滑肌分化，血管生成，動靜脈分化等多個方面有重要調(diào)控功能［9-11］。Jahnsen等［12］對早期胚胎流產(chǎn)的組織中 Notch-1蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)了 Notch-1蛋白可以調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在胚胎早期發(fā)育、著床及胎盤血管侵襲中占有非常重要地位。Cormier等［13］研究報道，除去卵黃囊和胎盤中Notch受體的小鼠，可發(fā)生嚴重血管形成及重塑障礙從而導(dǎo)致胚胎早期致死；而在內(nèi)皮細胞表達過多的小鼠則發(fā)現(xiàn)與Notch-1/4蛋白受體雙基因敲除小鼠類似的結(jié)果，表明Notch信號通路在胎盤的形成過程中非常重要，在早期胚胎發(fā)育的血管形成中起關(guān)鍵作用。

本資料顯示，Notch1基因表達水平在妊娠期高血壓胎盤組織及重度子癇前期患者胎盤組織中的表達呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明隨著疾病的發(fā)生，Notch1基因的表達水平逐漸下降，Notch1基因參與了在妊娠高血壓的早期發(fā)生過程，對妊娠合并高血壓的早期預(yù)防及后期治療具有重要意義。同時研究認為［4］，Notch1基因的表達狀況與有關(guān)生物學(xué)標記物的關(guān)系，Notch1基因的mRNA的表達量隨著年齡的增加逐漸下降，分別為（4.87±3.51）（＜35周歲孕產(chǎn)婦）和（4.12±2.56）（＞35周歲孕產(chǎn)婦）；同時，伴發(fā)圍生期不良結(jié)局的胎盤表達量更是顯著降低至（3.15±0.78）。這些下降趨勢表明Notch1基因在妊娠高血壓的演變過程中亦起到非常重要的作用。雖然Notch1mRNA的低表達與患者年齡及產(chǎn)后不良結(jié)局具有相關(guān)性，但其表達的統(tǒng)計學(xué)意義可能受限于樣本量的缺乏，還有待擴充樣本量進一步加深研究。

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Objective To study the expression of Notch1 gene in hypertensive disorder complicating pregnancy（pregnancy-induced hypertension），severe preeclampsia and normal placenta and its clinical significance. Methods The expression of Notch1 gene in 50 cases of pregnancy-induced hypertension，30 cases of pre-eclampsia and 50 cases of normal placenta were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative PCR. Results The expression of Nocth1 protein in PIH group，severed eclampsia group and normal control group were 52.0%，43.4% and 76% respectively. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）.The mRNA levels of Notch1 mRNA in PIH group，severe eclampsia group and normal control group were 4.10 ± 0.57，3.07 ± 0.45 and 4.88 ± 0.70 respectively. There was signif i cant difference between the two groups（P＜0.05）. Conclusion The low expression of Notch1 mRNA is associated with the development of PIH.

Notch1 Pregnancy-induced hypertension（PIH） Severe preeclampsia Real-time quantitative PCR Immunohistochemistry

浙江省人口及計劃生育項目（浙人口計生委［2011］50號）

313000 浙江省湖州市婦幼保健院

*通信作者