基于腸道菌群調節的GLP-1降糖作用機制研究

袁 曉 陳夏涼 陳 頡 吳巧敏 馮曉紅

基于腸道菌群調節的GLP-1降糖作用機制研究

袁 曉 陳夏涼 陳 頡 吳巧敏 馮曉紅

目的 從腸道菌群調節角度探討胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的降糖作用機制。方法 40只SD雄性大鼠，隨機分為正常組（N組）、模型組（M組）、二甲雙胍組（MET組）、GLP-1組（GLP-1組），每組各10只。除N組外，其余大鼠高脂飼料喂養8周后，按30mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）進行2型糖尿病造模。造模后，MET組、GLP-1組分別以二甲雙胍及GLP-1治療，N組和M組等量生理鹽水皮下注射，治療6周后，收集大鼠糞便，進行腸道菌群16SrDNA測序分析。結果 治療6周后，與N組比較，M組、MET組、GLP-1組大鼠空腹血糖均顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，MET組與GLP-1組空腹血糖均顯著下降（P＜0.01），且兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。Alpha多樣性上，observed_species、shanno、chao 3個指數均為N組＞GLP-1組＞MET組＞M組，與N組比較，M組、MET組3指數差異均有顯著統計學意義（P＜0.01），GLP-1組僅chao指數差異有統計學意義（P＜0.05）。與N組比較，M組擬桿菌門比例顯著下降（P＜0.01），變形菌門、厚壁菌門比例顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，GLP-1組擬桿菌門比例顯著升高（P＜0.01），變形菌門比例顯著下降（P＜0.01）。與N組比較，M組乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著下降（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，GLP-1組乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著下降（P＜0.01）。結論 GLP-1可能通過增加T2DM大鼠腸道菌群物種多樣性，同時提高乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌比例，從而起到調控血糖的作用。

腸道菌群 GLP-1 降糖 作用機制

糖尿病是一組由遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床綜合征，因胰島素分泌不足或（和）胰島素抵抗，引起糖、脂肪、蛋白質等一系列代謝紊亂。研究發現，腸道菌群失衡與T2DM的發生、發展可能密切相關［1］。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是回腸及結腸遠端L細胞內合成并分泌的一種腸促胰素，能通過促進胰島素合成和分泌、減少胰高糖素分泌及減緩胃排空等多種機制調控血糖。研究證實［2］，T2DM患者或小鼠胃腸旁路術后，在血糖控制改善的同時，GLP-1水平變化與腸道菌群變化存在一定的相關性。2016年 5月至11月作者應用16SrDNA測序技術，通過對正常大鼠、T2DM模型大鼠、二甲雙胍及GLP-1治療后大鼠腸道菌群的檢測，觀察T2DM大鼠腸道菌群的變化，并從腸道微生態菌群調節角度探討GLP-1的降糖作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±20）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心購于中科院上海實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 主要試劑和藥品 GLP-1選用美國禮來公司長效GLP-1類似物艾塞那肽注射液（商品名：百泌達）；二甲雙胍選用施貴寶公司藥品（商品名：格華止）。糞便DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。

1.3 主要儀器 PCR儀（LongGene，A200），離心機（ependorf，5424），16SrDNA測序儀（Miseq，2825）。1.4 方法 （1）動物分組：適應性喂養1周后，SD大鼠隨機分為4組：正常組（N組），模型組（M組），二甲雙胍組（MET組），GLP-1組，每組各10只。（2）模型制備：造模方法參考《藥理實驗方法學》，適應性喂養1周后，開始實驗：N組大鼠普通飼料喂養，其余3組大鼠高脂飼料喂養。喂養 8周后，空腹18～24h，M組、MET組、GLP-1組均按空腹體重30mg/kg腹腔注射STZ［用前以pH4.4的0.1mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成1%（10mg/ml）的濃度］，并繼續以高脂飼料喂養，72h后，禁食8h，尾靜脈采血，測空腹血糖，2次血糖≥16.7mmol/L，即造模成功；N組僅注射同等體積的生理鹽水。（3）給藥劑量及方法：模型建立后，開始藥物治療6周：GLP-1 組給予艾塞那肽注射液5μg/kg，2次/d皮下注射；MET組予二甲雙胍400mg/（kg·d），2次/d灌胃給藥；N組和M組予等量生理鹽水皮下注射，2次/d，連續6周。（4）檢測指標及方法：①血糖監測：造模成功后，M組、MET組及GLP-1組大鼠測空腹血糖，1次/周，尾靜脈取血，葡萄糖氧化酶法測定。②腸道菌群16SrDNA測序及信息分析：于治療6周后，以無菌方法收集4組大鼠糞便，將每只大鼠糞便分別放入滅菌EP管，-80℃保存，稱取0.1g大鼠便樣，采用TIANGEN公司糞便基因組DNA提取試劑盒提取樣品的總基因組DNA；16SrDNA測序通過對V3和V4雙可變區進行PCR擴增，純化產物建庫，文庫構建步驟遵循Illumina測序儀文庫構建方法。測序分析針對Illumina MiSeq 2X300bp paired-end測序數據進行分析，對于MiSeq測序獲得的雙端數據，根據barcode信息進行樣品區分，然后根據overlap關系進行merge拼接成tag，對拼接完成的數據進行數據過濾，隨后進行Q20、Q30等質控分析，對最終獲得clean數據進行OTU聚類分析和物種分類學等信息分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料用（x±s）表示，多組數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖比較 實驗開始，各組大鼠空腹血糖比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。喂養8周后，M組、MET組、GLP-1組空腹血糖均高于N組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。治療6周后，與N組比較，M組、MET組、GLP-1組空腹血糖均顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，MET組與GLP-1組空腹血糖均顯著下降（P＜0.01），且兩組間血糖差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖變化（x±s）

2.2 腸道菌群物種Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析，包括observed_ Species、shannon、chao指數以及simpson指數等，前面3個指數越大，最后一個指數越小，說明樣品中的物種越豐富。見表2。

表2 各組observed Species、shannon、chao及simpson指數比較（x±s）

2.3 各組大鼠腸道菌群門分類水平的主要物種組成比較 各組大鼠腸道菌群最主要的均由擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門三者組成。N組大鼠腸道菌群主要組成為擬桿菌門75.5%、厚壁菌門20.8%、變形菌門3.1%；M組大鼠為擬桿菌門59.5%、厚壁菌門34.9%、變形菌門5.0%；MET組大鼠為擬桿菌門59.1%、厚壁菌門34.2%、變形菌門5.0%；GLP-1組大鼠為擬桿菌門61.0%、厚壁菌門35.1%、變形菌門3.4%。與N組比較，M組擬桿菌門比例顯著下降（P＜0.01），變形菌門、厚壁菌門比例顯著升高（P＜0.01）；與M組比較，GLP-1組擬桿菌門比例顯著升高（P＜0.01），變形菌門比例顯著下降（P＜0.01），厚壁菌門比例差異無統計學意義（P＞0.05）；MET組擬桿菌門、厚壁菌門比例均顯著下降（P＜0.01），變形菌門比例差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠腸道菌群屬分類水平比較 與N組比較，M組大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著下降（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著升高（P＜0.01）。與M組比較，GLP-1組大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬比例顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著下降（P＜0.01）；MET組大鼠乳酸桿菌屬、螺桿菌屬比例顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌屬、鏈球菌屬比例顯著下降（P＜0.01），雙歧桿菌屬差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

腸道是人體最大的微生態系統，其中的大量微生物稱腸道菌群。據估計人體腸道中含有＞1000種細菌，總數＞1014個［3］。腸道菌群在合成營養成分、調節免疫、生物拮抗方面發揮著十分重要的作用。

腸道菌群失衡是指由于腸道菌群結構改變、細菌代謝活性變化或菌群在局部分布變化而引起的失衡狀態，較多因素如抗生素、腸蠕動改變及飲食變化等均可引起腸道菌群失衡。最新研究認為，腸道菌群失衡可引發機體免疫力下降、慢性炎癥反應、能量失衡等一系列問題，進而可導致代謝失調，最終可促使T2DM的發生［4］。

GLP-1是腸上皮細胞分泌的腸肽激素，除了刺激胰島β細胞分泌胰島素、抑制胰高糖素分泌等作用外，還能抑制迷走神經減少胃和十二指腸的蠕動，減少胃酸分泌、増加幽門壓力、延緩胃排空。基于GLP-1可作用于胃腸道引起腸蠕動的改變，而腸蠕動的改變可引起腸道菌群變化，且臨床和動物研究均顯示T2DM患者或小鼠胃腸旁路術后，GLP-1水平變化與腸道菌群變化存在一定的相關性［2］，因此，推測GLP-1可能可以通過對腸道菌群數量、結構等的調節起到調控血糖的作用。

本資料中Alpha多樣性分析顯示，與N組比較，M組大鼠腸道菌群物種多樣性顯著降低，這和黃旭東［5］等研究結果基本一致，提示腸道菌群物種數量下降與糖、脂代謝的異常有關，是T2DM等代謝性疾病的重要病因之一。經過GLP-1或二甲雙胍治療后，T2DM大鼠腸道菌群物種多樣性均有不同程度增加，且在血糖水平無顯著差異的情況下，GLP-1組腸道菌群多樣性增加較MET組更為顯著，接近正常組大鼠，提示GLP-1可能可以通過提高腸道菌群物種多樣性起到調控血糖的作用。

在腸道菌群門分類水平比較顯示，各組大鼠腸道優勢菌群都集中在擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。擬桿菌門包括了如多形擬桿菌等眾多益生菌，而變形菌門包括較多有害菌，如大腸桿菌、螺桿菌等。與N組比較，M組大鼠擬桿菌門比例顯著減少，變形菌門比例顯著增加，這與既往研究基本一致［6］。與M組比較，GLP-1組擬桿菌門比例顯著升高，變形菌門比例顯著下降，菌群比例恢復至接近正常組大鼠；而MET組擬桿菌門、厚壁菌門比例均下降，變形菌門比例差異無統計學意義。

在腸道菌群屬分類水平上比較顯示，與N組比較，M組大鼠乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌屬比例顯著下降，而大腸桿屬菌、鏈球菌屬等有害菌屬比例顯著升高。經治療后，MET組益生菌雙歧桿菌屬比例無顯著增加，而GLP-1組乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌比例顯著增加，大腸桿菌屬、鏈球菌屬等有害菌比例顯著下降，趨向正常大鼠菌群水平。

對于腸道益生菌調節血糖的機制，目前已有較多研究：部分益生菌產生的丁酸進入血液中具有抗炎和改善胰島素抵抗的作用，與胰島素抵抗及T2DM發生密切相關［7］；雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、乳球菌等益生菌能提高機體抗氧化應激的能力，還可提高鉻、鋅等微量元素的生物活性。益生菌還可以提高腸道細菌分泌酶的活性，如β-半乳糖苷酶、葡萄糖苷水解酶等活性，使糖類分解為人體更易吸收的預消化狀態，有助于促進外周組織對糖的攝取和利用［8］；益生菌可將一些多糖轉化為短鏈脂肪酸，部分被腸道黏膜直接利用，部分吸收入血，通過與脂肪細胞膜上的G蛋白偶聯的脂肪酸受體結合，促進游離脂肪酸和葡萄糖的吸收，并改善胰島素抵抗狀態［9］。

基于GLP-1對胃腸道生理功能具有一定調節作用，結合本資料結果顯示，GLP-1對腸道微生態菌群具有一定調節作用，可能通過增加T2DM大鼠腸道菌群物種的多樣性，同時提高乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌比例，從而起到調控血糖的作用。這為更全面闡釋GLP-1降糖作用機制，并為后續GLP-1基礎上T2DM治療靶點和治療藥物的研究提供可靠的實驗依據。

［1］ Backhed F, Ding H, Wang T, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(44): 15718-15723.

［2］ 李琳琳.db/db2型糖尿病模型小鼠腸道多形擬桿菌、產甲烷短桿菌與GLP-1的相關性研究. 中國藥理通訊, 2012, 29(3): 57-58.

［3］ Gill SR, Pop M, Deboy RT, et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science, 2006, 312: 1355-1359.

［4］ Amyot J, Semache M, Ferdaoussi M, et al. Lipopolysac-charides impair insulin gene expression in isolated islets of Langerhans via Toll-like receptor-4 and NF-kB signalling. PloS One, 2012, 7(4): e36200.

［5］ 黃旭東, 鄭曉鵬, 鄭趙利. 2型糖尿病患者腸道菌群的研究. 河北醫學, 2011, 17(8): 1041-1043.

［6］ Karlsson FH, Tremaroli V, Nookaew I, et al. Gut metagenome in European women with normal. Impaired and Diabetic glucose control. Nature 2013, 498(7452): 99-103.

［7］ Jakobsdottir G, Jadert C, Holm L, et al. Propionic and butyric acids, formed in the caecum of rats fed highly fermentable dietary fibre, are reflected in portal and aortic serum. Br J Nutr, 2013, 110(09): 1565-1572.

［8］ Donadill BA. Fermentative metabolism by the human gut microbiota. Gastro ententerol Clin Biol, 2010, 34(1): 17-23.

［9］ Talukdar S, Olefsky JM, Osborn O. Targeting GPR120 and other fatty acid sensing GPCRs ameliorates insulin resistance and inflammatory diseases. Trends Pharmacolog Sci, 2011, 32(9): 543-550.

Objective To explore the mechanism of hypoglycemic effect of GLP-1 on the regulation of intestinal fl ora. Methods 40 SD male rats were randomly divided into normal group，model group，metformin group and GLP-1 group，10 rats in each group. In addition to the N group，the other rats were fed with high fat diet for 8 weeks and intraperitoneal injection of STZ according to the 30mg/kg for type 2 diabetes model. MET and GLP-1 group were treated respectively with metformin and GLP-1，N and M groups were subcutaneous injected with normal saline for 6 weeks，then collected of rat feces to intestinal fl ora 16SrDNA sequence. Results Compared with N group，the fasting blood glucose of M，MET and GLP-1 group rats were signif i cantly elevated（P＜0.01）；compared with M group，MET and GLP-1 group were signif i cantly decreased（P＜0.01），and no signif i cant difference between the two groups（P＜0.01）.The 3 indexes of observed species,shanno,and chao were N grouP＞GLP-1 grouP＞MET grouP＞M group. Compared with N group，the 3 indexes’ difference of M group and MET group had statistical signif i cance（P＜0.01），while only Chao index difference of GLP-1 group had statistical significance（P＜0.01）. Compared with the N group，the proportion of Bacteroidetes of M group was signif i cantly decreased（P＜0.01），and the proportion of Proteobacteria and Firmicutes were signif i cantly increased（P＜0.01）.Compared with the M group，the proportion of Bacteroidetes of GLP-1 group was significantly increased（P＜0.01），and the proportion of Proteobacteria was signif i cantly decreased（P＜0.01）.Compared with N group，the proportion of Lactobacillus and Bif i dobacterium of M group were signif i cantly decreased（P＜0.01），and the proportion of Escherichia and Streptococcus were significantly increased（P＜0.01）.Compared with M group，the proportion of Lactobacillus and Bif i dobacterium of GLP-1 group were signif i cantly increased（P＜0.01），and the proportion of Escherichia and Streptococcus were signif i cantly decreased（P＜0.01）. Conclusion GLP-1 may increase the species diversity of the intestinal fl ora of T2DM rats，and increase the proportion of probiotics such as Lactobacillus and Bif i dobacteria，thus playing a role in regulating blood glucose.

Intestinal fl ora GLP-1 Hypoglycemic Mechanism

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2016KYB218）

310006 浙江中醫藥大學附屬第一醫院（袁曉 陳頡吳巧敏 馮曉紅）310006 浙江大學醫學院附屬第一醫院（陳夏涼）