Treg MMP-9及uPA mRNA在肺癌中的表達(dá)及臨床意義

熊 娟 朱 靜 張毅敏 馮建國(guó) 胡曉云 徐笑紅?

Treg MMP-9及uPA mRNA在肺癌中的表達(dá)及臨床意義

熊 娟 朱 靜 張毅敏 馮建國(guó) 胡曉云 徐笑紅?

目的 探討外周血中CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）mRNA表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）發(fā)展中的臨床意義及相關(guān)性。方法 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NSCLC患者及正常對(duì)照的外周血中Treg細(xì)胞的變化，熒光定量PCR檢測(cè)外周血中MMP-9及uPA mRNA的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 NSCLC患者外周血中Treg細(xì)胞、MMP-9及uPA mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常對(duì)照（P＜0.05）。在NSCLC患者中，Treg含量與分化程度、腫塊大小、TNM分期、有無(wú)脈管癌栓、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)（P＜0.05），與其它臨床病理因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）；外周血MMP-9 及uPA mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率均與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），此外MMP-9 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率亦與腫塊大小、有無(wú)脈管癌栓有關(guān)（P＜0.05）；通過(guò)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，外周血中Treg含量與MMP-9及uPA mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率有一定正相關(guān)性（r=0.178，P=0.028；r=0.162，P=0.045），且MMP-9與uPA mRNA陽(yáng)性表達(dá)率亦呈正相關(guān)性（r=0.309，P=0.001）。結(jié)論 Treg細(xì)胞、MMP-9及uPA mRNA表達(dá)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起重要作用。

非小細(xì)胞肺癌 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 尿激酶型纖溶酶原激活物

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是對(duì)人類(lèi)健康危害最大的腫瘤之一，患者死亡的首要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，探尋降低腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因以提高治療效果極為重要。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是人體免疫抑制性T細(xì)胞，少量存在于正常人體內(nèi)，主要起抑制免疫細(xì)胞活性過(guò)高而導(dǎo)致自身免疫性疾病。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在大量的Treg細(xì)胞［1］，其存在可能利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，利于腫瘤細(xì)胞通過(guò)部分缺失的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步向周?chē)M織浸潤(rùn)，與惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2-3］。作者通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)NSCLC患者外周血中Treg，MMP-9和uPA mRNA含量，探討其變化在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，并比較Treg細(xì)胞與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2012年1月至2015年6月本院治療非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者153例為觀察組，其中男103例，女50例；年齡36～83歲，平均年齡59.94歲。所有患者均經(jīng)病理檢查確診，首次血液標(biāo)本獲得時(shí)均未行手術(shù)、放療、化療及其他抗腫瘤治療，未曾使用免疫治療，且均無(wú)心、腦、肝、腎等器質(zhì)性疾病；另選擇同期本院體檢的健康者40例為對(duì)照組，其中男24例，女16例；年齡34～79歲，平均年齡57.58歲。所有標(biāo)本獲得均經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者知情同意。

1.2 方法 （1）儀器與材料：PC5標(biāo)記的鼠抗人CD4抗體、PE標(biāo)記的鼠抗人C127抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體及同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司（Beckman Coulter公司）；CytomicsTMFC500型流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司生產(chǎn)。RNA提取液Trizol為美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄采用大連寶生物TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit，熒光定量PCR試劑為江蘇碩世生物科技的核酸檢測(cè)試劑盒，PCR儀為美國(guó)ABI7500型熒光定量PCR儀。（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)：所有被觀察對(duì)象均采集空腹靜脈血2ml，經(jīng)EDTA-K2抗凝，使用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。操作步驟如下：取單克隆抗體CD4-PC5、CD25-FITC、CD127-PE及同型對(duì)照各20μl，加入抗凝全血100μl，室溫下避光孵育20min，再加入紅細(xì)胞裂解液500μl，避光孵育10min；加入PBS液漂洗2次，離心棄上清液后加入適量的PBS液，混勻后上機(jī)檢測(cè)。Cellquest軟件分析數(shù)據(jù)，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率，減去非特異性對(duì)照值，以CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比表示Treg細(xì)胞含量。（3）熒光定量PCR檢測(cè)MMP9 及uPA mRNA表達(dá)： 取EDTA-K2抗凝的外周血3～5ml，加入淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞PBMC，用1ml Trizol試劑進(jìn)行總RNA的提取；各組取1μg總RNA，70℃預(yù)變性5min，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，然后進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性5min后，95℃變性30s，60℃退火、延伸35s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后選擇FAM通道進(jìn)行熒光檢測(cè)，分析圖像。每次擴(kuò)增均使用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品5μl進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽錁?biāo)準(zhǔn)曲線，范圍為102～106拷貝/ml。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器自動(dòng)計(jì)算出標(biāo)本中MMP-9及uPA mRNA的拷貝數(shù)，以濃度＞500拷貝/ml設(shè)為陽(yáng)性，濃度＜500拷貝/ml為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)和LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者外周血Treg細(xì)胞表達(dá) 153例肺癌患者CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為（7.02±2.31）%，正常對(duì)照組為（4.53±0.86）%，NSCLC患者與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 NSCLC患者與正常對(duì)照中MMP-9、uPA mRNA表達(dá)比較 MMP-9 mRNA表達(dá)陽(yáng)性者在NSCLC患者外周血中為40例（26.1%），正常對(duì)照中2例（5%），與對(duì)照組比較，陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.520，P=0.001）；uPA mRNA表達(dá)陽(yáng)性者在NSCLC中為34例（22.2%），正常對(duì)照1例（2.5%），兩者的陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.308，P=0.004）。

2.3 Treg細(xì)胞、MMP-9 mRNA及uPA mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 Treg細(xì)胞、MMP9 mRNA及uPA mRNA表達(dá)與肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 外周血Treg細(xì)胞與MMP-9、uPA mRNA表達(dá)的相關(guān)性 外周血Treg細(xì)胞與MMP-9 mRNA表達(dá)（r=0.178，P=0.028）及uPA mRNA表達(dá)（r=0.162，P=0.045）具有一定正相關(guān)，且MMP-9與uPA mRNA表達(dá)亦呈正相關(guān)性（r=0.309，P=0.001）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲能力由弱到強(qiáng)的過(guò)程，而這一過(guò)程與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg是近年發(fā)現(xiàn)的一種在腫瘤免疫耐受中發(fā)揮重要作用的調(diào)節(jié)細(xì)胞，正常人外周血中含量極少，而在腫瘤患者外周血已發(fā)現(xiàn)存在大量的Treg細(xì)胞［4］，提示Treg細(xì)胞是機(jī)體參與腫瘤發(fā)生免疫應(yīng)答抑制的細(xì)胞之一。關(guān)于Treg細(xì)胞早期的研究多集中在CD4+CD25+Treg細(xì)胞，而CD4、CD25在人體內(nèi)缺乏特異性，F(xiàn)oxp3是一種叉頭狀/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的蛋白，是Treg細(xì)胞成熟和功能的標(biāo)志［5］。但Foxp3表達(dá)于細(xì)胞核，必須破膜才能將其染色，且此過(guò)程會(huì)造成細(xì)胞死亡，無(wú)法用于進(jìn)一步臨床研究，近年來(lái)有研究報(bào)道CD127（IL-7受體）與Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［6］，CD4+CD25+CD127-等同于CD4+CD25+Foxp3+。

本資料顯示，非小細(xì)胞肺癌NSCLC患者和健康體檢者外周血Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在患者組中，根據(jù)性別、年齡、吸煙史、病理組織學(xué)分類(lèi)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與該因素均無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。Ⅲ期、Ⅳ期患者Treg細(xì)胞均顯著高于Ⅰ期與Ⅱ期患者，Ⅳ期患者亦顯著高于Ⅲ期患者；此外肺癌的分化程度越低，腫塊越大，術(shù)后病理檢出脈管癌栓，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素在Treg細(xì)胞比例間均有顯著差異（P＜0.05）。但本資料顯示，Treg細(xì)胞在兩組不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的NSCLC患者外周血中的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這與Curiel等［7］學(xué)者研究結(jié)果類(lèi)似。通過(guò)對(duì)病理因素的分析，在一定程度上表明隨著肺癌病程的進(jìn)展，Treg細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答，患者抗腫瘤免疫減弱，有利于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［8］。

腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于各種蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)的協(xié)同作用，其中，MMP-9和uPA發(fā)揮了重要作用。MMP-9及uPA是降解細(xì)胞外基質(zhì)最重要的酶類(lèi)之一，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的一類(lèi)蛋白水解酶。本資料結(jié)果顯示肺癌外周血中MMP-9 及uPA mRNA表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，且其表達(dá)與肺癌的分期有一定關(guān)系，分期越差，表達(dá)率越高，提示其參與NSCLC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。MMP-9 mRNA或uPA mRNA表達(dá)陽(yáng)性的患者，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況更為常見(jiàn)，這可能由于晚期病變中腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)相對(duì)較多，增加了循環(huán)中腫瘤負(fù)荷，從而增加了檢出率。Sun Q等［2］認(rèn)為血清MMPs能夠用于預(yù)測(cè)腫瘤患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和預(yù)后；Beyer BC等［3］在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)uPA高活性與腫瘤浸潤(rùn)深度和腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，未分化癌uPA活力高于分化性癌，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)者表達(dá)比膨脹性生長(zhǎng)者高。此外本資料中MMP-9 mRNA表達(dá)亦與腫瘤體積的大小及脈管癌栓的存在與否密切相關(guān)。

MMP9能降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，使組織結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑并誘導(dǎo)腫瘤新生血管形成而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移［9］；而uPA作為一種絲氨酸蛋白水解酶，可將細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維蛋白及纖維結(jié)合素等催化降解，進(jìn)而將基質(zhì)中的Ⅲ型膠原降解，為腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的條件［10］。根據(jù)相關(guān)資料，腫瘤細(xì)胞的分期、分化及轉(zhuǎn)移的過(guò)程十分復(fù)雜，可能是Treg細(xì)胞通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)因子抑制物的平衡，進(jìn)一步激活基質(zhì)降解的一系列反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞穿透性增強(qiáng)，更利于腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移［11］。另有研究表明uPA可以激活MMP-9，開(kāi)啟MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解機(jī)制，uPA通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)通路酪氨酸的激活，與整合素β1結(jié)合，激活pro-MMP-9，從而調(diào)節(jié)MMP-9的活性［12］。

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Objective To investigate the clinical signif i cance of CD4+CD25+CD127-regulatory T cells（Treg）、matrix met alloproteinases-9（MMP-9）mRNA and urokinase plasminogen activator（uPA）mRNA in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）. Method The percentages of Treg were measured by fl ow cytometry，the mRNA expression of MMP-9 and uPA were measured by realtime fl uorescence quantitative PCR；and their relationship with the clinical characteristics of patients with NSCLC were analyzed. Results The frequency of Treg in peripheral blood，the positive rates of MMP-9 and uPA mRNA expression in NSCLC were signif i cantly higher than those in normal control（P＜0.05）. The proportion of Treg cells in peripheral blood of NSCLC was related with tumor differentiation，tumor size，TNM stage，vascular tumor thrombus and distant place metastasis（P＜0.05），but did not correlate to another clinicopathologic features（P＞0.05）；on the other hand，the positive rates of MMP-9 and uPA mRNA expression in NSCLC had a signif i cant impact on TNM stage，lymph node metastasis and distant place metastasis（P＜0.05），while the positive rates of MMP-9 mRNA expression were also affected by tumor size and vascular tumor thrombus（P＜0.05）. By spearman correlation analysis，there was positive correlation between the proportion of Treg cells in peripheral blood and that of MMP9 and uPA mRNA expression（r=0.178，P=0.028；r=0.162，P=0.045），in addition，the positive rates of MMP-9 and uPA mRNA expression were positively correlation（r=0.309，P=0.001）.Conclusion The proportion of Treg cells，MMP-9 and uPA mRNA expression in peripheral blood may play important roles in genesis，development and metastasis of NSCLC.

Non-small cell lung cancer Regulatory T cells MMP-9 uPA

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2016KYA044）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院

*通信作者