CRISPR系統在染色體標記方面的應用

張淑賢

摘 要 在細胞分化和發育過程中，細胞核的結構也在不斷的改變。哺乳動物基因組在細胞核內的裝配不是隨機的，且被認為與基因的調控有關，而且細胞核裝配缺陷還會造成一些人類疾病的產生。但是基因定位與基因表達簡單因果關系至今尚不明確，主要因為基因位置動態變化的分析依舊受限。隨著CRISPR系統的出現，其在標記方面的應用價值逐漸顯露出來。在CRISPR系統中，將Cas9蛋白替換為不具有切割能力的dCas9蛋白，將熒光蛋白與dCas9結合或與sgRNA的支架結構相結合，CRISPR系統便可用于染色體的標記。

關鍵詞 CRISPR 染色體標記 Casilio系統 F+E修飾 多色標記

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A

CRISPR-dCas9系統中，dCas9可以與熒光蛋白融合表達，sgRNA結合到特定基因位點后，熒光蛋白也被牽引到該處從而顯示基因的位置。除此之外，sgRNA后連有一段支架序列，用于dCas9蛋白的附著，若對支架進行修飾也可以提供其他的蛋白結合位點，用于招募熒光蛋白。sgRNA與蛋白質相比對基因組DNA的親和力更強，因此CRISPR可以作為一種簡單且效率高的手段，應用于活細胞中各種基因組位點的動態標記觀察中。傳統的CRISPR系統存在sgRNA表達水平較低，且與Cas9結合效率不高的問題，嚴重限制的了CRISPR標記系統功能的發揮。為了改進這一缺點，多種修飾過的CRISPR標記系統應運而生。

1 Casilio系統

2016年，Haoyi Wang等學者提出了Casilio系統，該系統是將CRISPR-dCas9與Pumilio/fem–3-binding factor （PUF）相結合，即對sgRNA的支架結構進行修飾，將其改造成PUF蛋白的結合區域（PUF binding site， PBS），再由PUF蛋白實現對其他效應因子的招募 。效應因子包括轉錄激活因子，熒光蛋白等，因此該系統不僅可用于染色體標記，還可用于轉錄調控。PUF作為一種8序列重復蛋白由36個氨基酸組成，可以識別一段8nt的RNA序列。這種能與RNA結合的結構域相當保守，PUF的識別原則如下：半磅氨酸和谷氨酰胺結合腺嘌呤，天冬氨酸和谷氨酰胺結合尿嘧啶，絲氨酸和谷氨酰胺結合鳥嘌呤，精氨酸和絲氨酸結合胞嘧啶 。利用這種簡單的配對原則，一種特殊8nt長的RNA序列（PUF binding site， PBS）被設計為sgRNA支架作為PUF的識別位點。PUF結構域與其他效應因子或蛋白標簽融合，如綠色熒光蛋白，可用于染色體標記。

2 F +E CRISPR-dCas9系統

2014年Baohui Chen等學者在將CRISPR系統應用于染色體標記時發現，單純的將Cas9蛋白替換成dCas9蛋白時，用于標記癌細胞的端粒時，每個細胞中只能看到10-40個亮點，遠遠少于細胞的端粒數。鑒于傳統的sgRNA結構存在穩定性差的原因，研究者對sgRNA的支架進行了修飾，sgRNA Pol-III莖環結構中連續的4個尿嘧啶堿基可能形成終止子， 造成U6 Pol-III轉錄過早的被終止，影響sgRNA結構的形成，因此利用堿基互補配對的方法，將第四個尿嘧啶堿基替換成腺嘌呤，得到sgRNA F，為了提高sgRNA與dCas9結合的穩定性，新增5對互補堿基對延長了sgRNA支架上發卡結構，得到sgRNA E。改變后結合在一起構成F+E CRISPR-dCas9系統，F+E的改變使sgRNA更加穩定的同時增強了其對Cas9蛋白的聚集作用。dCas9蛋白與熒光蛋白融合后便可應用于染色體標記 。

3多色標記系統

CRISPR-dCas9除了能應用于單色標記之外，還能應用于多色標記。為了實現多色標記，2015年Hanhui Ma等學者使用了三種不同來源的Cas9蛋白，即來自S. pyogenes的sp Cas9，來自 Neisseria meningitidis的Nm Cas9和來自Streptococcus thermophilus 的St1 Cas9，并將三者同時導入細胞中對基因進行標記 。這三種蛋白各自擁有自身與sgRNA的結合位點，互不沖突。這種CRISPR標記系統是將三種Cas9蛋白通過氨基酸突變的方式轉變成dCas9蛋白，然后分別融合不同顏色的熒光蛋白，即綠色熒光（GFP），藍色熒光（BFP）和紅色熒光（RFP），然后在其序列前添加相同或不同的sgRNA序列，構建成一個完整的系統。三種融合不同熒光的Cas9蛋白在同一質粒中表達，若sgRNA相同，則同一位點就能被三種顏色所顯示，若三種dCas9蛋白分別對應不同的sgRNA，則不同的位點顯示不同的顏色，從而達到多色標記的效果。除上述使用不同的Cas9蛋白進行三色標記系統外，還有一種CRISPR系統僅憑一種spCas9便可實現雙色標記。2016年，Siyuan Wang等學者采用對sgRNA進行修飾的方法，即在sgRNA支架上分別添加供MS2外殼蛋白（MCP）結合的MS2寡核苷酸適配子和與PP7外殼蛋白（PCP） 結合的PP7寡核苷酸適配子，兩種蛋白分別融合表達不同的熒光，使得該系統在只使用一種spCas9的前提下同時表達兩種熒光 。這種策略曾用于在同一細胞中招募不同功能的分子化合物以區分不同的基因組位置。若將兩種sgRNA支架的修飾方法融合應用于同一sgRNA中或兩種支架使用同種sgRNA時，則同一位點就能被兩種顏色所顯示，若兩者支架不在同一系統中，且分別對應不同的sgRNA，則不同的位點顯示不同的顏色。

參考文獻

[1] Cheng， A.W.， et al.， Casilio： a versatile CRISPR-Cas9-Pumilio hybrid for gene regulation and genomic labeling. Cell Res， 2016. 26（2）： p. 254-7.

[2] Chen， Y. and G. Varani， Engineering RNA-binding proteins for biology. FEBS J， 2013. 280（16）： p. 3734-54.

[3] Chen， B.， et al.， Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell， 2013. 155（7）： p. 1479-91.

[4] Ma， H.， et al.， Multicolor CRISPR labeling of chromosomal loci in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A， 2015. 112（10）： p. 3002-7.

[5] Wang， S.， et al.， An RNA-aptamer-based two-color CRISPR labeling system. Sci Rep， 2016. 6： p. 26857.