蝴蝶蘭莖尖脫毒再生體系建立與優化

朱嬌++馬蕾++劉芳++楊元軍++張冀華++泮海軍++董道峰

摘要：以蝴蝶蘭莖尖為外植體進行組織培養，研究培養基中無機鹽濃度、糖濃度、激素比例及外植體大小對其莖尖生長點成活率及脫毒效果的影響。結果表明，蝴蝶蘭莖尖組培脫毒外植體大小為0.2～0.4 mm，并附帶1個葉原基，可脫除ORSV病毒。適當降低培養基中無機鹽與6-BA濃度有利于提高莖尖生長點的成活率。培養基中添加15 g/L的綿白糖有利于莖尖的成活及生長。1/3MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA為最適宜的蝴蝶蘭莖尖培養基。

關鍵詞：蝴蝶蘭；脫毒；莖尖；再生

中圖分類號：S682.310.4+3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）06-0060-04

AbstractThe shoot tip of Phalaenopsis amabilis was cultured as explant to study the effects of inorganic salt concentration， sugar concentration， hormone proportion and explant size on survival rate and virus-free effect of shoot tip growing point. The results showed that when the explant had the size of 0.2 to 0.4 mm and attached 1 leaf primordium， the ORSV could be eradicated. When the inorganic salt and sugar concentration decreased properly， the survival rate of shoot tip growing point could improve. When 15 g/L soft sugar was added into culture medium， it was beneficial to survival and growth of shoot tip. The medium containing 1/3 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA was suitable for shoot tip culture of Phalaenopsis amabilis.

KeywordsPhalaenopsis amabilis； Virus free； Tip shoot； Regeneration

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）屬熱帶或亞熱帶的氣生蘭，因其株型美觀，花形奇特，色彩艷麗，花期長久，素有“蘭花皇后”之美稱，在國際花卉市場上具有很高的經濟價值[1]。隨著蝴蝶蘭種苗組培快繁技術的發展以及國際貿易的日趨頻繁，蘭花病毒病成為阻礙蝴蝶蘭產業發展的瓶頸[2]。由于病毒可通過蚜蟲、飛虱、機械性傷口等進行傳播，而蝴蝶蘭商品苗主要采用組織培養方式快繁，若感染病毒，很容易快速蔓延造成嚴重損失。目前蘭花病毒病害沒有有效的防治方法，為了從根源上避免病毒的擴散和危害，研究蝴蝶蘭的脫毒技術對培育無病毒種苗具有十分重要的現實意義。

莖尖培養不僅是組織培養的一種重要手段，也是脫毒的關鍵步驟之一。前人研究表明，病毒在植物體內分布不均，一般頂端分生組織細胞的分裂速度較快，超過病毒的繁殖速度，因此病毒含量很低，甚至不含病毒[3]。莖尖的成活率和脫毒率是決定莖尖脫毒技術成功的兩個關鍵因子。褐化是導致莖尖培養成活率降低的主要原因。褐化程度受植物基因型、取材時間、莖尖長度、培養基類型、激素配比、培養基添加物及培養方式等因素的影響。莖尖越小，褐化越嚴重，越容易死亡，尤其對于蘭花類植物，褐化尤為嚴重，是影響莖尖成活率的關鍵問題之一[4，5]。目前已在馬鈴薯、草莓、甘蔗、百合、葡萄等植物中利用莖尖脫毒技術成功獲得了脫毒種苗[6-10]。有關蝴蝶蘭脫毒種苗的研究已有報道[11，12]，但研究重點在于比較各種脫毒方法，對于莖尖再生培養體系的建立未進行深入研究。景維杰等[13]對培養基的無機鹽濃度、鉀濃度比例、氮素形態、植物生長調節劑進行了試驗優化，研究表明1/5大量元素的無機鹽濃度適合蝴蝶蘭莖尖生長點的培養，一定濃度范圍內，提高氮源中硝態氮的比例，或提高培養基中鉀的濃度比例，均有助于蝴蝶蘭莖尖生長點的存活，但該研究并未對影響莖尖成活率的基本培養基及糖濃度等重要因素進行深入研究[13]。

本試驗系統研究了莖尖大小、基本培養基、激素配比、糖濃度等對蝴蝶蘭莖尖組織培養再生的影響，旨在建立高效的蝴蝶蘭莖尖脫毒再生體系，為蝴蝶蘭脫毒種苗的研究及生產提供技術支持。

1材料與方法

1.1材料

以建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CymMV）和齒舌蘭環斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，ORSV） 復合感染的蝴蝶蘭1031組培苗為試驗材料。CymMV和ORSV病毒檢測試劑盒購自安德珍生物技術有限公司（ADGEN Biotechnology Co.， Ltd.）。

1.2方法

蝴蝶蘭組培苗的無菌操作在超凈工作臺上進行。在 40倍冷光源解剖鏡下用解剖針和手術刀剝去生長點外圍的幼葉，露出微凸、穹形、發亮的生長點。切下生長點快速放在培養基上表面。基本培養基試驗、激素配比試驗及糖濃度試驗所用外植體均為0.2～0.4 mm帶1個葉原基的莖尖生長點。每瓶接種3個莖尖，每個處理8瓶，重復2次。接種后暗處理2周，然后進行光照培養，光照條件800 lx，光照時間為10 h/d，溫度22～28℃。培養40 d后，統計莖尖的成活率、褐化率及死亡率。試驗設計如下。

1.2.1基本培養基試驗基本培養基共設5個處理：M1，MS；M2，1/2MS；M3，1/3MS；M4，1/4MS；M5，1/5MS。其中，1/2MS、1/3MS、1/4MS、1/5MS是指將MS中的大量元素變為原來的1/2、1/3、1/4、1/5。每個處理培養基均添加3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA + 25 g/L綿白糖+ 1.0 g/L AC（活性炭）+15%CW（椰乳）。

1.2.2激素配比試驗激素配比共設5個處理：A1，8.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA；A2，5.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA；A3，3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；A4，2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA；A5，1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA。每個處理培養基均添加1/2MS +25 g/L綿白糖+1.0 g/L AC +15%CW。

1.2.3糖濃度試驗綿白糖濃度共設5個處理：T1，10 g/L；T2，15 g/L；T3，20 g/L；T4，25 g/L；T5，30 g/L。其中每種培養基均添加1/2MS+ 3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC +15%CW。

1.2.4莖尖大小試驗莖尖大小共設3個處理：S1，≤0.2 mm，莖尖生長點不帶葉原基；S2，0.2～0.4 mm，莖尖生長點帶1個葉原基；S3，≥0.5 mm，莖尖生長點帶2個葉原基。培養基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L綿白糖+1.0 g/L AC+15% CW。

1.3數據處理

試驗數據均采用Microsoft Excel 2007及SPSS 18.0統計軟件進行分析，以鄧肯氏新復極差法測驗，比較0.05水平上的差異顯著性。

2結果與分析

2.1無機鹽濃度對蝴蝶蘭莖尖組織培養的影響

由表1可見，無機鹽濃度對蝴蝶蘭莖尖褐化率、成活率及外植體生長有顯著影響。在一定濃度范圍內，隨著無機鹽濃度的降低，莖尖成活率顯著增加。無機鹽濃度太高或是太低均導致莖尖生長點發黃褐化、玻璃化明顯。其中M3處理的莖尖葉色翠綠，長勢健康，為莖尖生長點培養的最適宜濃度。

2.2激素配比對蝴蝶蘭莖尖組織培養的影響

由表2可見，不同激素配比的培養基中蝴蝶蘭莖尖外植體褐化率、成活率及長勢特征差異明顯。A3處理莖尖成活率最高，但莖尖芽小，長勢弱；而A5處理成活率雖較A3處理略低，但莖尖生長勢健壯，為最適激素配比。另外，高濃度的6-BA易導致莖尖生長點發黃褐化、玻璃化嚴重，且有變異現象。

2.3糖濃度對蝴蝶蘭莖尖組織培養的影響

由表3可見，糖濃度對蝴蝶蘭莖尖褐化率、成活率有顯著的影響，且不同糖濃度處理外植體長勢特征差異明顯。隨著糖濃度的升高，莖尖成活率顯著降低，糖濃度太高或是太低均導致莖尖生長點發黃褐化、玻璃化明顯。其中T2處理莖尖長勢健康，葉色翠綠，為莖尖生長點組織培養最適宜的糖濃度。

2.4莖尖大小對其組培成活率和脫毒效果的影響

隨著外植體增大，莖尖培養成活率相應提高，主要是因為材料越小創傷面積相對越大，成活率低。其中，S1處理莖尖全部死亡；S2處理莖尖成活率為8.3%，有2株未檢測到ORSV病毒，病毒脫除率為40%，表明莖尖大小介于0.2～0.4 mm之間，帶1個葉原基，有利于脫除ORSV病毒；S3 處理莖尖成活率為21.6%，但均未脫除CymMV和ORSV病毒，表明莖尖大小大于0.5 mm，帶2個葉原基，外植體成活率雖高，但不能達到脫毒效果（表4）。

3討論與結論

莖尖大小是影響脫毒率的主要因素。通常切取的莖尖越小，脫除效果越好，但成活率低。不同的植物種類因基因型和個體的差異，脫毒莖尖長度也不相同。席夢利等[14]研究發現當宜興百合莖尖接種長度為0.8～2.0 mm時，成活率可達90%～100%，但起不到脫除病毒的作用；只有0.8 mm以下的莖尖才有可能獲得無病毒植株。而本研究結果表明蝴蝶蘭莖尖大小介于0.2～0.4 mm且帶1個葉原基時，有利于脫除ORSV病毒，但莖尖生長緩慢，易褐化死亡，成苗率較低。這可能是由于植物材料不同所致。

MS培養基中無機鹽的濃度對莖尖成活率影響顯著，本研究中隨著培養基中無機鹽濃度的降低，莖尖成活率明顯增加。景維杰等[13]研究表明，培養基的無機鹽濃度對蝴蝶蘭莖尖組織培養的外植體存活率有重要影響，無機鹽濃度過高造成的培養基高滲透壓逆境降低了蝴蝶蘭莖尖組織培養的存活率，這與本研究的結果一致。

激素配比對植物組織培養有重要的影響。本研究發現過高或過低的激素配比均不利于莖尖的成活，激素配比過高容易導致莖尖發生變異死亡，過低又不利于誘導生長點啟動，這與賀嘉[15]的研究結果一致。糖濃度是影響培養基滲透壓的重要因素，而滲透壓又直接影響了莖尖生長點的成活率，本研究結果表明糖濃度與莖尖成活率呈負相關關系。

綜上可得，1/3MS+ 1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +15 g/L綿白糖為最適宜的蝴蝶蘭莖尖生長點培養基。本試驗中蝴蝶蘭莖尖存活率雖有所提高，但脫毒比率仍然較低。分析原因可能是：第一，本研究采用CymMV和ORSV兩種病毒復合感染蝴蝶蘭，加大了脫除病毒的難度；第二，莖尖剝離技術不精準，還有待進一步改進。因此建議在以后的研究中對于復合感染的材料，可以先使用病毒抑制試劑（如病毒唑等）進行預培養，降低外植體所帶病毒的濃度，再配合莖尖培養脫毒；其次，在莖尖基本培養基中添加抗褐化試劑如活性炭或抗壞血酸，以減弱外植體的褐化程度，以提高莖尖成活率。

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