潤肺膏對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ含量的影響

鄒愛玲，柳 新，于文瀟

（1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264670；2.煙臺渤海制藥集團有限公司，山東 煙臺 264003）

潤肺膏對哮喘大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ含量的影響

鄒愛玲1，柳 新2，于文瀟2

（1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264670；2.煙臺渤海制藥集團有限公司，山東 煙臺 264003）

目的 觀察潤肺膏對哮喘模型大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）含量的影響，探討其可能的藥理作用機制。方法 制備炎性哮喘動物模型，利用酶聯免疫法（ELISA）檢測BALF中TNF-α和IFN-γ含量的變化。結果 與正常組比較，模型組大鼠BALF中TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；IFN-γ的含量顯著降低（P＜0.01），與模型組大鼠比較，給予中、高劑量潤肺膏后，BALF中TNF-α的含量顯著降低（P＜0.01）；給予高劑量潤肺膏后，BALF中IFN-γ的含量顯著升高（P＜0.05）。結論 潤肺膏具有平喘功能，其作用機制可能與抑制BALF中TNF-α的生成以及提高IFN-γ的含量有關。

潤肺膏；支氣管哮喘；BALF；TNF-α；IFN-γ

支氣管哮喘（bronchial asthma）是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應性、可逆性氣流受限，反復發作可導致氣道重塑，主要表現為上皮下膠原沉積、氣道平滑肌增殖、黏液腺增生以及血管再生等改變。其發病機制十分復雜，但多種細胞因子在哮喘的發病過程中起著十分重要的作用。TNF-α和IFN-γ作為重要的炎癥細胞因子都與哮喘病的發作密切相關[1-3]。潤肺膏是煙臺渤海制藥集團有限公司生產的國內獨家產品，主要由萊陽梨膏、黨參、黃芪、紫菀、百部、川貝母組成，具有潤肺益氣、止咳化痰之功效。本研究通過分子生物學的方法，觀察潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中TNF-α和IFN-γ含量的影響，進一步探討潤肺膏的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD種大鼠，雄性，體重（230±30）g，由山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（魯）20030020。

1.2 主要儀器及試劑

儀器：精密電子天平；TGL-臺式水平離心機；HH-4數顯恒溫水浴鍋；酶標儀；無菌注射器；霧化器；有機玻璃霧化箱（31 cm×31 cm×36 cm）。

試劑：潤肺膏，規格250g/瓶，煙臺渤海制藥集團有限公司（批號130471）；雞卵白蛋白；氫氧化鋁干粉；定喘止嗽丸（北京同仁堂天然藥物有限公司，批號13030004），TNF-α、IFN-γ的ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號A07061406）

1.3 動物模型制備[4-5]

選取體重在200～260 g健康雄性SD大鼠72只，隨機分為正常組（生理鹽水），模型對照組（生理鹽水），潤肺膏低（2 g/kg）、中（4 g/kg）、高（8 g/kg）劑量組，陽性藥（定喘止嗽丸，2 g/kg）組，每組12只，各組均給予相同飼育條件。除正常組外，其余各組分別于第1天和第8天腹腔各注射含1 mg雞卵白蛋白和100 mg氫氧化鋁凝膠生理鹽水注射液1 mL，從第15天開始用1%雞卵白蛋白6 mL霧化吸入，每天1次，每次20 min，持續至第44天。正常組依照上述方法，以相同劑量生理鹽水代替腹腔注射和霧化吸入。

1.4 BALF的收集

結扎右側肺門，行左支氣管肺泡灌洗。經右支氣管插管將4℃生理鹽水2 mL緩慢注入右肺中，在肺內停留30秒后吸出，反復沖洗3遍。回收灌洗液于4℃，1000 r/min，離心10 min，取上清液-80℃保存待檢。

1.5 BALF中TNF-α、IFN-γ含量的測定

依據ELISA試劑盒所述方法，測定TNF-α及IFN-γ的含量。

1.6 數據統計方法

數據以均數±標準差（SD）表示，利用spss10.0統計軟件處理。存活率的比較用卡方檢驗，其余各組數據之間采one-way ANOVA法方差分析，方差不齊時采用Dunnett’c方法作多重比較。P＞0.05為統計學無顯著差異，P＜0.05為統計學差異顯著。

2 結 果

2.1 潤肺膏對動物行為的影響

各組大鼠行為學觀察，模型組及各給藥組在第1次激發后均可見呼吸加深加快、點頭運動、腹肌收縮等喘息癥狀，及抓撓口鼻、口唇紫紺、扭體等表現，模型組的癥狀表現較其他各組嚴重；正常對照組無上述癥狀出現。

2.2 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中TNF-α含量的影響

與正常組比較，哮喘模型大鼠BALF中TNF-α的含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，潤肺膏中、高劑量組均能有效地減少BALF中TNF-α的含量（P＜0.01）。見圖1。

圖1 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中TNF-α含量的影響注：與正常組比較，++P＜0.01有極顯著性差異；與模型組比較，**P＜0.01有極顯著性差異；*P＜0.05有顯著性差異

2.3 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中IFN-γ含量的影響

與正常組比較，哮喘模型大鼠BALF中IFN-γ的含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，潤肺膏高劑量組和陽性藥組均能有效地升高BALF中IFN-γ的含量（P＜0.05）。見圖2。

圖2 潤肺膏對哮喘模型大鼠BALF中IFN-γ含量的影響注：與正常組比較，++P＜0.01有極顯著性差異；與模型組比較，**P＜0.01有極顯著性差異；*P＜0.05有顯著性差異

3 討 論

隨著生活壓力的增大以及大氣污染的加重，哮喘的發病率逐年上升，嚴重影響患者的健康和生活質量。哮喘的發病機制十分復雜，有研究表明[2]，其發病機制為嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等多種細胞和細胞組分參與引起的特異性的慢性氣道炎癥，其發病過程是多個細胞因子、多種炎癥細胞及炎癥介質相互聯系并相互作用而導致的。

TNF-α是一種可由多種細胞產生的具有廣泛生物學活性的前炎癥細胞因子，是哮喘病發病過程中的重要因素。在體內，高水平的TNF-α慢性刺激和釋放可引起組織免疫病理損傷及炎癥介質的瀑布樣連鎖反應，最終引起氣道痙攣，使血管通透性增加、微血栓形成、氣道粘膜水腫等，從而導致哮喘發作[6]。研究表明，支氣管哮喘患兒急性發作期血清TNF-α水平升高，且與其預后有相關性，說明TNF-α的含量變化在哮喘的發病過程中具有重要作用[7]。IFN-γ是種氣道炎性的介質，能引發氣道中的上皮細胞脫落，免疫調節活性比較強，IFN-γ減少是變應性疾病危險的因素[3]。IFN-γ和白介素-4（IL-4）的不平衡是哮喘的一個主要特征，也是哮喘發病的重要機制之一，調節Th1/Th2細胞的平衡是哮喘治療的重要靶點[8]。

潤肺膏處方以萊陽梨清膏為主藥，潤肺生津，配以黨參，黃芪補中益氣，氣旺則痰行水消；另外加以紫菀、百部、川貝母、滋潤補肺，肺潤則咳止，以上諸藥配伍，既有協同作用，又能增強療效。臨床上治療咳嗽、哮喘、慢性支氣管炎等癥具有明顯的治療效果。由實驗結果可知，哮喘模型大鼠的BALF中TNF-α的含量較正常組具有明顯升高，IFN-γ的含量顯著降低，給予潤肺膏干預后，其含量均有顯著改善，說明 TNF-α和IFN-γ與哮喘的發病機制密切相關，并且可能是潤肺膏平喘作用的靶點之一。具有的作用機制雖然還不十分清楚，今后仍需作進一步研究，但這為潤肺膏的藥理機制研究提供了科學依據。

[1] RubiraGarcia N.Tunor necrosis factor[J].Allergol Immunopathol( Madr),2000,28(3):115.

[2] 李學良,許朝霞,王憶勤.支氣管哮喘發病機制的研究進展[J].中華中醫藥學刊,2012,30(9):1960.

[3] 王華巧.IL-4、IFN-γ、和TGF-β1在支氣管哮喘發病機制中的研究進展[J].吉林醫學,2014,35(18):4047.

[4] 袁益明,王曾禮,劉小菁,等.基質金屬蛋白酶在哮喘大鼠氣道結構重建中的作用[J].中華內科雜志,2001,40:700.

[5] 李昌崇,胡曉光,陳小芳,等.牛膝多糖對幼年哮喘大鼠模型氣道炎癥的影響[J].中華結核和呼吸雜志,2003,26:644.

[6] 胡 賓.支氣管哮喘患兒血清TNF-α、IL-6水平及其臨床意義[J].醫學理論與實踐,2010,23(7):812.

[7] 吳紅梅,于 瑩,張 莉,等.支氣管哮喘患兒血清總IgE、TNF-α檢測及其臨床意義[J].中國實驗診斷學,2010,14(8):1244-1246.

[8] 張 琦,董 亮,李麗珍,等.以T2bet/GATA23的比率作為評價哮喘患者Th1/Th2失衡指標的探討[J].細胞與分子免疫學雜志,2005,21(1):118-119.

本文編輯：吳玲麗

R526.25

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ISSN.2095-8242.2017.16.2975.02