哲里木科左中旗植被區(qū)甘草遺傳多樣性的ISSR分析

2017-06-28 15:54:12布日額陳香梅

臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志(電子版) 2017年16期

布日額，陳香梅

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028041）

·基礎(chǔ)研究·

哲里木科左中旗植被區(qū)甘草遺傳多樣性的ISSR分析

布日額，陳香梅

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028041）

本文對哲里木植被區(qū)科左中旗具有代表性的6個區(qū)域的甘草遺傳多樣性進(jìn)行研究，分析遺傳變異程度，得出結(jié)論哲里木植被區(qū)科左中旗甘草遺傳特征明顯，環(huán)境較為穩(wěn)定。

哲里木；甘草；遺傳多樣性；ISSR

甘草為我國所產(chǎn)的大宗藥材，是我國應(yīng)用最為廣泛的一種藥用植物。在我國集中分布于三北地區(qū)，而內(nèi)蒙古是主要產(chǎn)區(qū)之一。近年來，已有運用RFLP，RAPD，ISSR等分子標(biāo)記方法對不同產(chǎn)地甘草的遺傳多樣性研究的報道[1]。本試驗從哲里木植被區(qū)科爾沁左翼中旗具有代表性的6個區(qū)域采取野生甘草作為樣本，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析。采集的所有樣本均由內(nèi)蒙古民族大學(xué)布日額教授給予鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料

采自內(nèi)蒙古通遼市科爾沁左翼中旗6個區(qū)域，8份甘草單株樣本，選取新鮮無損害的葉片，分別對應(yīng)編號，放入硅膠劑中干燥保存（表1）。

表1 采集甘草實驗材料

1.2 試劑和儀器

1.2.1 儀器

PCR擴(kuò)增儀PCR-2720，JY-122型電泳儀，JY-SPC水平電泳槽，紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-4200），紫外分光光度計（200 C型），DK-SD型電熱恒溫水槽，內(nèi)吐C-16B離心機(jī)。

1.2.2 試劑

分子量Marker、TaqDNA聚合酶、溴化乙錠，購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA提取

采用多糖多酚植物DNA提取試劑盒（OMEGA生物技術(shù)有限責(zé)任公司）進(jìn)行DNA提取。

2.2 ISSR-PCR反應(yīng)條件建立及引物篩選

ISSR擴(kuò)增反應(yīng)條件：25 μL的反應(yīng)體系12.5 μL PCR MasterMix（含3mmol·L-1MgCl2，100 mmol·L-1KCl，0.1U TaqDNA聚合酶，20 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1dNTP），2 μL引物，1 μL模板DNA，加雙蒸水至 25 μL。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，由加拿大University of British Columbia，UBC Primer Set #9（Microsatellite），設(shè)計公布的引物No.801～900中選取38條引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。對采集的8個甘草樣品進(jìn)行預(yù)試驗，得到15條重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰的引物，其序列和退火溫度見表2。

表2 15條引物名稱，序列及退火溫度

2.3 ISSR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增程序見表3。

表3 PCR反應(yīng)條件

PCR產(chǎn)物在4℃保存。

取20 μLPCR產(chǎn)物，以Marker DNA Ladder為相對分子質(zhì)量標(biāo)記，在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，在凝膠成像儀上觀測結(jié)果，照相。引物ISSR 854和ISSR 895所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物見圖1。

2.4 多態(tài)性譜帶分析

通過ISSR-PCR反應(yīng)共得到15張圖譜，擴(kuò)增條帶的相對分子質(zhì)量從1500～5000不等。15條引物共得到80條帶，其中21條表現(xiàn)出多態(tài)性，占總帶數(shù)的26.3%，平均每條引物擴(kuò)增的DNA譜帶數(shù)為5條，多態(tài)位點百分率（PPB）在16.67%～40%。