糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷時Mdivi-1對七氟醚后處理的影響

師高翔，韓沖芳，段應磊

（山西醫科大學麻醉學系，山西 太原 030001）

·基礎研究·

糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷時Mdivi-1對七氟醚后處理的影響

師高翔，韓沖芳*，段應磊

（山西醫科大學麻醉學系，山西 太原 030001）

目的 糖尿病大鼠應用線粒體分裂抑制劑Mdivi-1，觀察七氟醚后處理對其心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的影響。方法 健康成年雄性SD大鼠，體重230～280 g，高脂高糖飼養聯合注射鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。取模型成功大鼠40只，根據計算機生成的隨機數分為4組（n=10）：假手術對照組（C組）、缺血/再灌注組（I/R組）、七氟醚后處理組（Sev組）、Mdivi-1+七氟醚后處理組（Mi-Sev組）。采用Langendorff系統灌注心臟，以95%O2預氧合的K-H液平衡灌注30 min后，缺血30 min再灌注120 min建立MIRI模型，C組持續平衡灌注180 min。Sev組、Mi-Sev組再灌注開始時用含3%七氟醚的K-H液灌注10 min；Mi-Sev組用含Mdivi-1 1μmol/L的K-H液再灌注120 min。再灌注120 min時TTC法測定心肌梗死面積，TUNEL法測定細胞凋亡指數（AI），Western blot法測定caspase-3表達水平。結果 與C組比較，其余3組心肌梗死面積增大，AI升高，caspase-3表達上調（P＜0.05）；與I/R組比較，Mi-Sev組心肌梗死面積減小，AI降低，caspase-3表達下調（P＜0.05），Sev組與I/R組之間以上指標無顯著差異（P＞0.05）；與Sev組比較，Mi-Sev組心肌梗死面積減小，AI降低，caspase-3表達下調（P＜0.05）。結論 Mdivi-1可在糖尿病狀態下抑制線粒體異常分裂從而減輕缺血心肌細胞凋亡，恢復七氟醚后處理對大鼠MIRI的保護作用。

糖尿病；心肌再灌注損傷；麻醉藥；吸入；細胞凋亡

糖尿病是冠心病的獨立危險因素，臨床上合并糖尿病的心臟手術患者逐漸增多[1]，在冠脈旁路移植術等心臟手術中常涉及心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）。研究表明，七氟醚后處理可通過抑制細胞凋亡而減輕正常大鼠MIRI，但這種保護作用在糖尿病條件下明顯降低甚至缺失[2]。線粒體融合/分裂失衡、線粒體過度分裂導致的線粒體損傷是MIRI的中心環節，而動力相關蛋白1（Drpl）是介導線粒體分裂的主要分子[3]。筆者所在課題組前期研究表明：糖尿病大鼠MIRI時細胞凋亡加重，機制可能與Drpl表達上調有關[4]。本研究擬通過特異性抑制劑Mdivi-1抑制Drpl活性，探究糖尿病大鼠MIRI時缺血心肌細胞凋亡情況，評價Mdivi-1對七氟醚后處理心肌保護作用的影響，為臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與糖尿病模型制備

由山西醫科大學動物中心購置健康成年SD大鼠（雄性），體重230～280 g。參照文獻[5]的方法制備2型糖尿病大鼠模型。高脂高糖飼料（豬油：蛋黃：基礎飼料=1:1:8）喂養4周后，禁食8 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，Sigma公司）30 mg/kg，72 h后測定空腹血糖。以血糖≥16.7mmol/L且出現明顯“三多”癥狀，認為模型制備成功，高血糖水平繼續保持四周者進入實驗。

1.2 動物分組

取糖尿病模型大鼠40只，根據計算機Excel軟件生成的隨機數分為4組（n=10）：對照組（C組）、缺血/再灌注組（I/R組）、七氟醚后處理組（Sev組）、七氟醚后處理+抑制劑Mdivi-1組（Mi-Sev組）。

1.3 Langendorff模型制備及分組處理

參照文獻[6]的方法制備Langendorff模型并進行各組實驗。大鼠術前禁食12 h，腹腔注射水合氯醛（1.5mg/kg）和肝素（1000 IU/kg），待到麻醉起效后，迅速開胸剪下心臟，浸泡入4℃無鈣磷酸鹽緩沖液中，爾后掛靠于Langendorff裝置上，恒流（10 ml/min）灌注預氧合（95%O2-5%CO2）的K-H緩沖液（mmol/L）：NaCl 118.5、KCl 4.7、MgSO41.2、NaHCO325.0、KH2PO41.2、葡萄糖 11.1、HEPES 10.0和CaCl22.5，37℃條件下pH=7.4。模型平衡灌注30 min過程中出現頻發室早、室速或室顫者退出實驗，各組所缺樣本重新按隨機數字表法補充。I/R組、Sev組、Mi-Sev組平衡灌注30 min后，缺血30 min再灌注120 min建立MIRI模型，C組持續平衡灌注180 min。Sev組、Mi-Sev組再灌注開始時用含3%七氟醚的K-H液灌注10 min；Mi-Sev組用含Mdivi-1（Sigma公司）1μmol/L的K-H液再灌注120 min。

1.4 指標測定方法

1.4.1 TTC法測定心肌梗死面積

再灌注120min時每組隨機取3例再次原位結扎LAD，經頸內靜脈注入伊文藍（1%，1 m1），迅速取出心臟，垂直于心臟縱軸方向將左心室自心底向心尖切成2 mm切片（5片），置于l%TTC（37℃，pH=7.4）中，避光孵育15 min，4%多聚甲醛固定48 h。將已染色的心肌切片拍照，利用Image pro plus軟件分析圖像，分析分別測定藍色、紅色及白色區域的面積，計算梗死面積百分比（白色區面積/左心室總面積×100%）。

1.4.2 TUNEL法測定缺血區心肌細胞凋亡指數（AI）

每組隨機取3例心肌組織以4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片，脫蠟至水后TUNEL染色，光學顯微鏡（40×）下觀察，棕褐色顆粒在胞核中顯現者為陽性細胞，每個切片隨機挑選5個視野觀察，計算AI。

1.4.3 Western blot法測定心肌組織caspase-3的表達水平

每組剩余4例心肌組織凍存于80℃冰箱用于Western blot法檢測心肌組織caspase-3的表達水平。打碎心肌組織制備勻漿，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。總蛋白上樣量30μg，以12%濃度的凝膠電泳進行分離。冰浴下恒流（300 mA）濕法轉膜2 h，體積分數5%的脫脂奶粉封閉1 h后與caspase-3Ⅰ抗（兔抗鼠多克隆抗體，1:1000）4℃共孵育過夜。TBST洗膜后，與Ⅱ抗（HRP標記的山羊抗兔抗體IgG，1:3000）共孵育，用TBST洗膜后加入ECL發光液，進行顯色和曝光，采用Alpha view SA軟件進行灰度值半定量分析，計算目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值反映其表達水平。

1.5 統計學方法

實驗結果采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組方差齊性的情況下組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

與C組比較，I/R組、Sev組和Mi-Sev組心肌梗死面積增大，AI升高，心肌caspase-3表達上調（P＜0.05）；與I/R組比較，Mi-Sev組心肌梗死面積減小，AI降低，心肌caspase-3表達下調（P＜0.05），Sev組與I/R組之間以上指標無顯著差異（P＞0.05）；與Sev組比較，Mi-Sev組心肌梗死面積減小，AI降低，心肌caspase-3表達下調（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 四組大鼠心肌梗死面積，AI，caspase-3表達的比較（±s）

表1 四組大鼠心肌梗死面積，AI，caspase-3表達的比較（±s）

注：與C組比較，aP＜0.05 與I/R組比較，bP＜0.05 與Sev組比較，cP＜0.05

C組03.8±1.30.20±0.08 I/R組54±4a41.2±2.4a0.54±0.13a Sev組51±6a39.6±2.0a0.50±0.16ab Mi-Sev組38±7abc30.7±2.7abc0.32±0.09abc

圖1 四組大鼠心肌caspase-3表達的Western blot結果

3 討 論

本研究通過高脂高糖飼料飼養大鼠誘導胰島素抵抗，聯合小劑量STZ腹腔注射針對性破壞胰島β細胞的方法制備2型糖尿病大鼠模型。模型制備成功后4周開始實驗，模擬糖尿病心肌對I/R敏感的自然病程和時間條件，接近于臨床[5]，

采用文獻[6]的方法制備大鼠離體心臟Langendroff灌注模型，可排除機體神經、體液等多種因素的干擾，同時排除了藥物分布、代謝等方面的影響，便于直接觀察處理因素對研究結果的作用。本研究結果表明：與C組比較，I/R組、Sev組和Mi-Sev組再灌注120 min時心肌梗死面積增大、AI升高，提示糖尿病大鼠離體MIRI模型制備成功。

本研究參照文獻，Sev組、Mi-Sev組于再灌注最初10 min內給予含3%七氟醚的K-H液；M-SP并用含Mdivi-1 1μmol/L的K-H液再灌注120 min。結果表明，與I/R組相比，Sev組心肌梗死面積、AI差異無統計學意義，驗證了糖尿病因素可取消七氟醚后處理對心肌的保護；Mi-Sev組心肌梗死面積減小，提示在Drpl活性抑制的條件下七氟醚后處理減輕了糖尿病大鼠MIRI。

細胞凋亡是MIRI的主要機制之一，本研究從凋亡角度評價MIRI程度。糖尿病因素導致的線粒體過度分裂是凋亡的上游信號，Drpl則是主導線粒體分裂的關鍵蛋白[6]。本研究采用TUNEL法計算凋亡指數，并結合western blot法精確測定caspase-3蛋白的表達水平，較為全面地評價凋亡的變化。

Caspases蛋白家族啟動和執行哺乳動物細胞凋亡，其中caspases-3執行細胞凋亡作用最為關鍵[7]。本研究結果表明，與Sev組比較，Mi-Sev組caspases-3表達下調，反映了凋亡過程減弱的分子機制，與TUNEL法結果吻合。因此認為MIRI的減輕通過抑制線粒體分裂從而抑制凋亡來實現。

綜上所述，Mdivi-1特異性抑制Drp1活性、減少線粒體過度分裂從而抑制缺血心肌細胞的凋亡，在糖尿病狀態下使七氟醚后處理對MIRI的保護作用顯效。因客觀條件所限，本研究未能測定細胞氧化應激水平，對心肌損傷/保護變化的認識有局限性，研究有待于進一步深入。

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[3] Calo L,Dong Y,Kumar R,et al. Mitochondrial dynamics:an emerging paradigm in ischemia-reperfusion injury[J].Curr Pharm Des,2013,19(39):6848-6857.

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本文編輯：李 豆

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ISSN.2095-8242.2017.017.3195.02

山西省衛生計生委科研課題（2015002）

韓沖芳，E-mail：hanchongfang2003@foxmail.com