異常黏液質(zhì)證候大鼠陰莖組織差異性表達(dá)microRNA的篩選及生物信息學(xué)分析*

木薩?艾麥爾蔣 萍毛吾蘭?買買提依明馬文靜美合日古麗?薩塔爾斯依提?阿木提王天宇阿地力江?伊明**

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）;

2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室; 3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室; 4.中心實(shí)驗(yàn)室

·論 著·

異常黏液質(zhì)證候大鼠陰莖組織差異性表達(dá)microRNA的篩選及生物信息學(xué)分析*

木薩?艾麥爾1△蔣 萍2△毛吾蘭?買買提依明3馬文靜4美合日古麗?薩塔爾1斯依提?阿木提1王天宇1阿地力江?伊明1**

1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）;

2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室; 3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室; 4.中心實(shí)驗(yàn)室

目的 篩選異常黏液質(zhì)證候及藥物干預(yù)大鼠陰莖組織差異表達(dá)microRNA（miRNA），并驗(yàn)證miR-140-3p和miR-486兩項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)，探討其生物學(xué)意義。方法 取80只性功能正常SD雄性大鼠，從中隨機(jī)抽取10只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，余70只為造模組，用芫荽實(shí)+菠菜實(shí)+濕寒性環(huán)境的干預(yù)條件建立異常黏液質(zhì)證候模型，通過生物學(xué)表征確認(rèn)模型成功后，隨機(jī)分為證候模型組、證候藥物組。伊木薩克片干預(yù)3周后，提取陰莖組織總RNA進(jìn)行miRNA Illumina高通量測(cè)序，篩選出異常黏液質(zhì)證候及藥物干預(yù)相關(guān)的候選差異表達(dá)miRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的可靠性，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果 篩選出證候相關(guān)miRNA候選標(biāo)志物15個(gè)（上調(diào)13個(gè)，下調(diào)2個(gè)），伊木薩克片干預(yù)相關(guān)miRNA候選靶點(diǎn)標(biāo)志物3個(gè)（均下調(diào)），驗(yàn)證結(jié)果顯示miR-486在證候模型組較正常對(duì)照組表達(dá)升高（P＜0.05），miR-486和miR-140-3p在證候藥物干預(yù)組較證候模型組表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論miR-486可作為異常黏液質(zhì)證標(biāo)志物，miR-140-3p、miR-486可作為伊木薩克片靶點(diǎn)標(biāo)志物，但仍需大樣本量驗(yàn)證。

異常黏液質(zhì)證候; 微RNAs; 伊木薩克片; 計(jì)算生物學(xué)

維吾爾醫(yī)學(xué)（維醫(yī)）作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)寶庫中的重要成員，在陽痿、早泄及少、弱精子癥等男科疾病的診療中具有顯著的臨床診療優(yōu)勢(shì)。前期工作中，本研究團(tuán)隊(duì)，通過病因造模的理念成功建立了異常黏液質(zhì)證大鼠模型，并從中成功篩選出陽痿病證模型，且系統(tǒng)研究了該證候與病證模型生物學(xué)表征、性行為能力與勃起功能改變。本研究則在此基礎(chǔ)上，從陽痿維醫(yī)臨床主要證型異常黏液質(zhì)證角度，采用Illumina Hiseq高通量深度測(cè)序分析技術(shù)，篩查了差異表達(dá)的microRNA，構(gòu)建了候選標(biāo)志物體系，對(duì)miR-140-3p和miR-486兩項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證后，開展了生物信息學(xué)分析，從證候角度探討了異常黏液質(zhì)型陽痿病證的發(fā)病機(jī)制及其上述指標(biāo)可能的作用，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80只具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠，體質(zhì)量（250±25）g。20只性成熟雌性大鼠（去勢(shì)），體質(zhì)量（180±15）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠自由飲食水，12h/12h晝夜交替飼養(yǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度（18~22）℃，相對(duì)濕度50%~60%。

二、實(shí)驗(yàn)試劑與材料

濕寒性飼料（新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心制備）；阿樸嗎啡（Apomorphine，APO，美國Sigma公司）、戊巴比妥鈉（美國sigma公司，批號(hào)：P013601）；黃體酮（寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：S151009）；雌二醇（寧波市三生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：B130613）；伊木薩克片（新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20151202）；miRneasy Mini Kit （批號(hào)：154027952）、miScriptⅡ RT Kit（批號(hào)：154032004）、miScript SYBR Green PCR試劑盒（批號(hào)：154034292）、U6引物（批號(hào)：20160831012s）、rno-miR-140引物（批號(hào)：20140905186）、rno-miR-486引物（批號(hào)：20160427117）均購自德國QIAGEN公司。

三、實(shí)驗(yàn)儀器

RXZ-436LD型人工氣候箱（寧波江南儀器廠），5810R型低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司），LT3002E 型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司），超低溫冰箱（青島海爾公司），IQ2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司），Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司），高壓滅菌鍋（日本TOMY 公司）。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（一）動(dòng)物模型的建立和分組

1. 建立動(dòng)物模型：隨機(jī)取10只雄性SD大鼠為正常對(duì)照組（N），余70只為造模組。按照前期工作[1]制作異常黏液質(zhì)證候大鼠模型，從中篩選出陽痿病證模型（用于其它研究），

2. 分組：異常黏液質(zhì)證候模型未成陽痿大鼠隨機(jī)分為證候模型組（ZM）和證候藥物組（ZY）。證候藥物組伊木薩克片干預(yù)劑量為250mg/kg灌胃，每日1次，證候模型組為等劑量溶劑干預(yù)，時(shí)間3周。

（二）取材

實(shí)驗(yàn)終結(jié)時(shí)，1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40mg/kg）麻醉后，剪取陰莖組織，去除筋膜，縱向剖開分為兩半分裝，液氮速凍后，-80℃凍存。

（三）miRNA測(cè)序分析

正常對(duì)照組、證候模型組和證候藥物組3組，每組取3個(gè)陰莖組織樣本構(gòu)成混合樣本，干冰保存，寄送至深圳華大基因有限公司，委托其進(jìn)行miRNA測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。過程簡述如下：（1）提取樣品總RNA，使用PAGE膠分離不同片段大小的RNA。切取18~30nt 之間的條帶，回收Small RNA；（2）配制3’連接體系，連接并純化回收連接產(chǎn)物；（3）配制5’連接體系，連接并純化回收連接產(chǎn)物；（4）RTPCR擴(kuò)增，使用PAGE膠回收純化PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物溶于EB solution，完成文庫構(gòu)建；（5）構(gòu)建好的文庫使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCRSystem檢測(cè)質(zhì)量和產(chǎn)量。使用Illumina HiSeq測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)分析，通過過濾比對(duì)，除去其他的非編碼RNA，通過與miRBase 21.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，注釋miRNAs。

（四）大鼠陰莖組織總RNA提取

取50mg組織在研缽中研磨成粉末，放入1.5mL離心管，按照miRneasy Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取總RNA，Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度。

（五）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time qPCR）

按照QIAGEN公司的miScriptⅡRT 試劑盒操作說明將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)miScript SYBR Green PCR試劑盒說明書操作，以50ng cDNA為模板，U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條件：95℃預(yù)變性15min入循環(huán)，94℃變性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，循環(huán)數(shù)40， 4℃ 5min。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法將不同樣本的RQ值（RQ=2-ΔΔCt）進(jìn)行比較分析，其中△Ct=Ct目的miRNA-CtU6，△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct正常對(duì)照組。2-ΔΔCt為兩者模板中相應(yīng)目的miRNA含量的相對(duì)比值。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

（六）差異表達(dá)的miRNA靶基因預(yù)測(cè)

用Targetscan、miRDB以及miRanda等3個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)的miRNA靶基因同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)，取3個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件的交集進(jìn)行分析。

（七）miRNA靶點(diǎn)的通路分析

通過用the Gene Ontology（http://www. geneontology.org/）對(duì)其靶基因進(jìn)行功能顯著性富集分析；用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（http://www.kegg.jp/）預(yù)測(cè)其可能的靶基因和信號(hào)通路。

五、統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組數(shù)據(jù)間進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)后，行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，如滿足方差分析要求，多組之間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one way analysis of variance，one way ANOVA），如不能滿足方差分析要求，則求出秩次后進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

一、差異表達(dá)miRNA結(jié)果

證候模型組與正常對(duì)照組相比，顯著差異的miRNA有147個(gè)，其中以log2 Ratio的絕對(duì)值＞0.8為條件，進(jìn)行綜合分析，構(gòu)建陰莖組織miRNA候選標(biāo)志物15個(gè)，其中上調(diào)13個(gè)，下調(diào)2個(gè)（表1）。證候藥物干預(yù)組顯著差異的miRNA有131個(gè)，其中以log2 Ratio的絕對(duì)值＞0.8為條件，結(jié)合綜合分析，構(gòu)建miRNA藥物候選靶點(diǎn)標(biāo)志物3個(gè)，均為下調(diào)（表2）。在15個(gè)證候指標(biāo)中，miR-434-3p、miR-486被藥物反向調(diào)控，提示上述2個(gè)miRNA在該證候發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

表1 異常黏液質(zhì)證候大鼠陰莖組織候選miRNA標(biāo)志物

表2 藥物干預(yù)異常黏液質(zhì)證候大鼠陰莖組織候選miRNA標(biāo)志物

二、miR-140-3p、miR-486的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果顯示，miR-486表達(dá)水平在證候模型組較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），經(jīng)藥物干預(yù)后，與證候模型組顯著降低（P＜0.05）（圖1）；miR-140-3p相對(duì)表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比雖有升高，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），經(jīng)藥物干預(yù)后，表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖2）。

圖1 miR-486在各組的相對(duì)表達(dá)水平注：與N組比較，*P＜0.05；與ZM組比較，#P＜0.05

圖2 miR-140-3p在各組的相對(duì)表達(dá)水平注：與ZM組比較，#P＜0.05

三、miR-140-3p、miR-486的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，miR-140-3p用Targetscan、miRDB以及miRanda 3個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件同時(shí)進(jìn)行預(yù)測(cè)， miR-140-3p有30個(gè)預(yù)測(cè)靶基因，miR-486有21個(gè)預(yù)測(cè)靶基因（表3）。

四、miR-140-3p、miR-486靶基因的GO分析

結(jié)果顯示，miR-140-3p主要涉及調(diào)節(jié)大分子物質(zhì)的代謝過程、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝過程、調(diào)控細(xì)胞代謝過程、蛋白質(zhì)代謝過程、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路。miR-486主要涉及細(xì)胞蛋白質(zhì)的修飾作用、細(xì)胞的代謝過程的正性調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡、代謝過程正性調(diào)控、膽固醇代謝（表4、表5）。

表3 差異表達(dá)的microRNA的靶基因

表4 miR-140-3p預(yù)測(cè)靶基因生物學(xué)功能

表5 miR-486預(yù)測(cè)靶基因生物學(xué)功能

五、miR-140-3p、miR-486靶基因的pathway分析

結(jié)果顯示，miR-140-3p主要參與Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、促性腺激素信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信號(hào)通路等。miR-486主要參與抗利尿激素調(diào)節(jié)的水分重吸收作用、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、縫隙連接、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、泛素蛋白介導(dǎo)的水解作用（表6、表7）。

表6 miR-140-3p預(yù)測(cè)靶基因pathway分析

表7 miR-486預(yù)測(cè)靶基因pathway分析

討 論

在維醫(yī)學(xué)在內(nèi)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，陽痿是男性陰莖不舉或舉而不堅(jiān)為主要特征的病癥，并可伴有性欲減低和早泄等癥狀，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中陽痿被稱之為陰莖勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED），陰莖不能獲得或維持充分的勃起，并持續(xù)影響性生活 6 個(gè)月以上的生理功能障礙。在長期醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，維醫(yī)對(duì)陽痿形成了一定的理論建樹和較為成熟的診療優(yōu)勢(shì)，且以療效顯著著稱。在以往研究工作中，我們選擇陽痿維醫(yī)臨床主要證型異常黏液質(zhì)證作為切入點(diǎn)，在維醫(yī)基礎(chǔ)理論和造模理念的指導(dǎo)下，采用濕寒飼料、濕寒環(huán)境（高濕和低溫）等多因素復(fù)合刺激的病因造模方法，建立了異常黏液質(zhì)證（證候）大鼠模型，并成功篩選出陽痿（病證結(jié)合）模型，以自然恢復(fù)和對(duì)證方藥干預(yù)法，進(jìn)行了反證和系統(tǒng)評(píng)價(jià)，證明該模型成功地模擬了陽痿病證的臨床特征[2]。在對(duì)其生殖生物學(xué)基礎(chǔ)的研究過程中，發(fā)現(xiàn)該證候及陽痿病證大鼠模型陰莖海綿體平滑肌組織纖維化，并出現(xiàn)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控異常，尤其是陰莖組織NO-cGMP-PDE5和VIP、CGRP-cAMP、RhoA/Rho等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效應(yīng)分子和第二信使表達(dá)調(diào)控發(fā)生異常，而方藥伊木薩克片可糾正或調(diào)節(jié)上述功能途徑發(fā)揮藥理作用[3-7]。結(jié)合以往的研究，我們認(rèn)為上述改變與藥物的調(diào)控中，miRNA可能發(fā)揮著重要的作用，但其具體機(jī)制不詳。

本研究在上述工作基礎(chǔ)上，通過高通量測(cè)序技術(shù)，并進(jìn)行綜合分析，在陰莖組織中，篩查并確定了證候相關(guān)候選miRNA標(biāo)志物15個(gè)，藥物靶點(diǎn)候選miRNA標(biāo)志物3個(gè)，而15個(gè)候選證候標(biāo)志物中miR-486和miR-140-3p 兩個(gè)指標(biāo)被藥物反向調(diào)控，我們推測(cè)該證候及其組織病變可能與體內(nèi)miRNA表達(dá)和調(diào)控水平改變關(guān)系密切，方藥可能通過影響證候相關(guān)的microRNA表達(dá)調(diào)控異常改變而發(fā)揮作用。

驗(yàn)證結(jié)果顯示，miR-486在證候模型組顯著上調(diào)（P＜0.05），藥物干預(yù)后出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)變化（P＜0.05），與測(cè)序結(jié)果完全一致。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-486主要涉及細(xì)胞的代謝過程的正性調(diào)控、程序性細(xì)胞死亡等功能；主要參與抗利尿激素調(diào)節(jié)的水分重吸收作用、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、縫隙連接、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)等通路。10號(hào)染色體缺失張力蛋白同源磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）是miR-486的預(yù)測(cè)靶基因[8,9]，該蛋白質(zhì)通過負(fù)調(diào)控PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝[10,11]。推測(cè)，miR-486可能通過調(diào)控該信號(hào)通路影響異常黏液質(zhì)證候的發(fā)生發(fā)展，并可被伊木薩克片干預(yù)所調(diào)控，但上述推測(cè)尚需基于進(jìn)一步的功能研究來證實(shí)。

miR-140-3p驗(yàn)證結(jié)果為，在證候模型組中雖為上調(diào)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），經(jīng)藥物干預(yù)后出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)性下調(diào)（P＜0.05）。miR-140-3p主要涉及調(diào)控細(xì)胞代謝過程蛋白質(zhì)代謝過程、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。主要參與Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、促性腺激素信號(hào)通路、絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶信號(hào)通路等；結(jié)合預(yù)測(cè)的靶基因功能分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β3（transforming growth factor beta 3，TGF-β3）是miR-140-3p的預(yù)測(cè)靶基因，TGF-β3具有抑制纖維化的作用[12,13]。miR-140-3p在藥物干預(yù)后下調(diào)，可能通過上調(diào)TGF-β3，拮抗TGF-β/Smad3激活所致纖維化，而減輕陰莖組織纖維化，改善勃起功能。該結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平上闡釋了本團(tuán)隊(duì)前期工作中發(fā)現(xiàn)的異常黏液質(zhì)證候與陽痿病證大鼠模型血清睪酮含量降低、陰莖組織平滑肌/膠原纖維比例降低、組織間隙水腫、勃起功能減退這一改變，揭示了維藥伊木薩克片干預(yù)后上述改變得到顯著調(diào)整這一作用的內(nèi)在機(jī)制[14]，提示miR-140-3p可作為藥物靶點(diǎn)的標(biāo)記物。

綜上所述，本研究通過Illumina HiSeq 2000測(cè)序技術(shù)篩選并構(gòu)建了異常黏液質(zhì)證候與對(duì)證方藥干預(yù)靶點(diǎn)大鼠模型陰莖組織候選標(biāo)志物，并從中初步確定miR-486可作為證候標(biāo)志物，miR-140-3p、miR-486作為藥物靶點(diǎn)標(biāo)志物，但仍需進(jìn)一步做大樣本量驗(yàn)證，并開展基于標(biāo)志物在陰莖勃起功能障礙發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用與藥物調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步深入研究。

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2 阿地力江?伊明, 范強(qiáng), 哈木拉提?吾甫爾, 等. 維醫(yī)異常黏液質(zhì)證候與陽痿病證大鼠性行為學(xué)改變的研究. 中國男科學(xué)雜志 2011; 25(9): 20-23, 28

3 張盼盼, 劉鳳霞, 阿地力江?伊明, 等. 異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠性腺軸改變的形態(tài)學(xué)研究. 中國男科學(xué)雜志 2014; 28(7): 8-13

4 阿地力江?伊明, 潘建春, 哈木拉提?吾甫爾, 等. 維醫(yī)異常黏液質(zhì)證候與陽痿病證大鼠模型生殖激素的改變及其生物學(xué)意義. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2012; 35(11): 1438-1444

5 朱彥劉瑩, 買買提祖農(nóng)?買蘇爾, 劉鳳霞, 等. 伊木薩克片對(duì)異常黏液質(zhì)型陽痿病證模型大鼠陰莖組織形態(tài)學(xué)的影響. 中國男科學(xué)雜志 2015; 29(6): 9-14

6 毛吾蘭?買買提依明, 張盼盼, 劉鳳霞, 等. 維醫(yī)異常黏液質(zhì)型陽痿病證大鼠模型陰莖組織中ET-1的改變及其生物學(xué)意義. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2016; 39(5): 535-537

7 劉鳳霞, 臘博雅, 劉琪, 等. RhoA/Rho激酶在異常黏液質(zhì)證候及陽痿病證大鼠陰莖中的表達(dá)及伊木薩克片干預(yù)的研究. 中國男科學(xué)雜志 2016; 30(9): 5-9

8 Small EM, O'Rourke JR, Moresi V, et al. Regulation of PI3-kinase/Akt signaling by muscle-enriched microRNA-486. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107(9): 4218-4223

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10 曾靜波, 李玉秀, 孫琦, 等. 羅格列酮和二甲雙胍治療對(duì)胰島素抵抗KKAy糖尿病小鼠肝及橫紋肌組織PTEN蛋白表達(dá)的影響. 中華老年多器官疾病雜志 2010; 9(6): 529-532

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（2016-12-28收稿）

Screening of microRNAs pro fi les in rats model of abnormal phlegmatic syndrome and its medication disproof and bioinformatics analysis*

Musa?Aimaier1△, Jiang Ping2△, MaoWulan?Maimaitiyiming3,
Ma Wenjing4, Meiheriguli?Sataer1, Siyiti?Amuti1,Wang Tianyu, Adilijiang?Yiming1**
1.Department of Human Anatomy, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;
2.Department of Physiology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University ; 3.Department of Biology, College of Basic Medicine, Xinjiang Medical University; 4.Central Laboratory, Xinjiang Medical University Corresponding author: Adilijiang?Yiming, E-mail: adljym@126.com

Objective To select the differently expressed microRNAs(miRNA) on abnormal Phlegmatic syndrome and it’s medicine intervention rats's penile tissue, validate miR-486 and miR-140-3p, discuss the signi fi cance of biology of miR-486 and miR-140-3p.Methods Eighty healthy mature male SD rats were enrolled in this study, 10 of them were taken randomly as the control group, the other rats(70) were in the model group. Animal models of abnormal phlegmatic syndrome were established by treated with spinach and coriander diet in the cold humid environment. Biological characterization of rats were observed weekly until the models were successfully established. The rats were randomly divided into abnormal phlegmatic syndrome model group and abnormal phlegmatic syndrome model's medicine interventiongroup. Counterevidence was performed for 3 weeks, then penis tissue of the rats was collected to extract total RNA, and then subjected to Illumina Hiseq technology for screening differentially expressed miRNA, and then cluster analysis was performed, the candidate miRNA was selected and validated by qPCR.Results Total of 15 differentially expressed miRNAs related to Phlegmatic syndrome were identi fi ed , including 13 up-regulated miRNAs and 2 down-regulated miRNA; Three downregulation miRNAs related to target of medicine intervention were inversely regulated by Yimusake tablets treatment. The results of RT-qPCR showed that compare to control group, miR-486 was up-regulated in abnormal phlegmatic syndrome model group(P<0.05), miR-486 and miR-140-3p were down-regulated in abnormal phlegmatic syndrome model's medicine intervention group as compared to the abnormal phlegmatic syndrome model group(P<0.05).Conclusion miR-486 may be associated with the development of abnormal Phlegmatic syndrome. miR-140-3p, miR-486 may be as targets of Yimusake intervention.

abnormal phlegmatic syndrome; MicroRNAs; Yimusake tablets; computational biology

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.001

R 698.1

資助： 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（NO.2016D01C176）；中國博士后科學(xué)基金第58批面上資助-西部地區(qū)博士后人才資助計(jì)劃(2015M582773XB)**

，E-mail: adljym@126.com△共同第一作者