毛皮DNA提取方法的比較研究

楊芳芳，羅利玲，周曉芳

(廣州纖維產(chǎn)品檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510000)

毛皮DNA提取方法的比較研究

楊芳芳，羅利玲，周曉芳

(廣州纖維產(chǎn)品檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510000)

通過(guò)比較兩種不同的DNA提取方法，發(fā)現(xiàn)使用毛發(fā)裂解緩沖液處理毛皮樣品提取DNA的效果更好，可以滿足后期DNA分析的要求。

毛皮；DNA提取；方法

隨著生活水平的提高，毛皮服飾越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。除具有美觀、舒適、保暖等特點(diǎn)外，也可以突顯消費(fèi)者高貴、典雅的氣質(zhì)。但是毛皮制品的價(jià)格相對(duì)較高，尤其是不同動(dòng)物物種來(lái)源的產(chǎn)品，價(jià)格相差更是懸殊。在利益的驅(qū)使下，許多不法分子生產(chǎn)和銷(xiāo)售仿制、偽制甚至假冒產(chǎn)品，極大擾亂了市場(chǎng)。與毛皮相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有QB/T 1261-1991[1]和GB/T 16988-1997[2]。QB/T 1261-1991標(biāo)準(zhǔn)僅針對(duì)毛皮的工業(yè)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行了解釋?zhuān)瓷婕懊しN類(lèi)的鑒別方法。GB/T 16988-1997標(biāo)準(zhǔn)僅介紹了羊毛和兔毛的顯微鏡鑒別法，而市面上出現(xiàn)較多的水貂毛皮、貉子毛皮等的鑒別方法沒(méi)有提及。目前國(guó)內(nèi)毛皮制品材質(zhì)鑒別方法主要研究方向分為以下4種：感官經(jīng)驗(yàn)鑒別法、顯微鏡鑒別法、紅外光譜鑒別法和DNA分析法[3]。

不同物種之間DNA必然存在差異。利用DNA分析法主要是對(duì)毛皮的DNA進(jìn)行提取然后進(jìn)行DNA序列分析或擴(kuò)增后分析。無(wú)論哪種分析，其前提和難點(diǎn)都是從動(dòng)物纖維或毛皮上提取DNA。主要原因是市面上的毛皮制品一般都會(huì)經(jīng)過(guò)鞣制、酶軟化、浸酸、鞣制、復(fù)鞣、水洗、中和、加脂和染整過(guò)程[4]。毛皮上的DNA在經(jīng)過(guò)復(fù)雜的加工過(guò)程后被嚴(yán)重破壞。本文通過(guò)比較兩種不同的DNA提取方法，優(yōu)化提取步驟，建立一種有效提取毛皮DNA的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

材料：毛皮樣品(裁取10 cm2，剪去樣品表面的毛干，只留下根部約2～3 mm，將樣品剪碎備用)。

試劑：Tris，SDS，蛋白酶K，tris飽和酚(東盛生物科技有限公司)；EDTA，NaCl，濃鹽酸，三氯甲烷，無(wú)水乙醇，三水合乙酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠)；DTT(美國(guó)AndyBio公司)；Triton-X 100(廣州艾比利生物科技)。

儀器：CF16RXⅡ離心機(jī)(日本HITACHI公司)，HB-100恒溫金屬浴(杭州博日科技有限公司)，M200 PRO酶標(biāo)儀(德國(guó)Tecan公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 配置緩沖溶液

(1)1M Tris-Cl(pH 8.0):稱(chēng)量121.1 g Tris置于1 L燒杯中，加入約800 ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓尤霛恹}酸調(diào)節(jié)pH值到8.0。

(2)SNET緩沖液:20 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，400 mmol/L NaCl，1%(m/v)SDS按比例配好后，用0.45 μm孔徑的硝酸纖維素膜過(guò)濾除菌備用。

(3)毛發(fā)裂解緩沖液：100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)，80 mmol/L DTT，1%(m/v)Triton-X 100，0.4 mg/L蛋白酶K按比例配好后，用0.45 μm孔徑的硝酸纖維素膜過(guò)濾除菌備用。

(4)TE緩沖液：10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)和水按比例配好。

1.2.2 毛皮的組織消化分解

方法1 本法從Richard Palmiter和Ralph Brinster建立的組織基因組DNA提取方法衍生而來(lái)。在SNET中加蛋白酶K制備成裂解緩沖液，將準(zhǔn)備好的樣品加入到裂解緩沖液中，建議每毫升裂解緩沖液加50 mg樣品。然后將加好樣品的反應(yīng)管置于56 ℃孵育18～24 h[5]。

方法2 參考毛發(fā)基因的提取方法，在毛發(fā)裂解緩沖液中加入準(zhǔn)備好的樣品，建議每毫升裂解緩沖液加50 mg樣品，然后將加好樣品的反應(yīng)管置于56 ℃孵育18～24 h[5]。

1.2.3 DNA的抽提和純化

采用酚氯仿抽提法對(duì)DNA進(jìn)行抽提和純化。在生物安全柜內(nèi)，將從步驟1.2.2獲得的反應(yīng)管內(nèi)的SNET裂解緩沖液或毛發(fā)裂解緩沖液吸至一支干凈離心管中，然后向管內(nèi)加入等體積的tris飽和酚，顛倒混勻，注意不要用力震蕩。混勻后，12 000 r/min離心25 min。離心后吸上清到一支新離心管內(nèi)，向管內(nèi)加入等體積的tris飽和酚，顛倒混勻，注意不要用力震蕩。混勻后，12 000 r/min離心25 min。離心完成后，吸上清到一支新離心管內(nèi)并加入等體積的氯仿，顛倒混勻。混勻后，12 000 r/min離心25 min。離心完成后，吸上清到一支離心管內(nèi)，加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉溶液和2.5倍體積的預(yù)冷(-20 ℃)的無(wú)水乙醇。混勻后于-20 ℃靜置3 h。13 000 r/min離心25 min，吸棄上清液，保留沉淀。向管內(nèi)加入1 ml 75%乙醇，吹洗管壁上的沉淀，13 000 r/min離心10 min，吸棄上清液。晾干或置于50 ℃干燥，直至無(wú)液體殘留。向管內(nèi)加入50 μL TE溶液溶解管壁內(nèi)的DNA。在酶標(biāo)儀上測(cè)定所提取DNA的濃度和A260/A280比值。

2 結(jié)果和分析

A260/A280這個(gè)概念是于1945年Warburg和Christian提出的，是蛋白制品被核酸所污染程度的很好指標(biāo)。現(xiàn)在被廣泛用于估計(jì)核酸純度，當(dāng)1.8≤A260/A280<2.0時(shí)DNA純度較高，可直接用于進(jìn)一步的DNA分析，并且A260/A280比值越接近這個(gè)范圍純度越高。當(dāng)A260/A280=1.73，表示DNA純度只有30%，對(duì)后期的DNA分析，尤其是PCR分析影響較大。如果是要做PCR分析，一般認(rèn)為A260/A280<1.7或A260/A280>2.0是無(wú)法滿足分析要求的。不同的DNA分析方法對(duì)DNA的量及純度的要求不同，對(duì)于純度達(dá)不到后期分析要求的，可以考慮對(duì)提取的DNA進(jìn)行二次純化。本文研究的兩種DNA提取方法對(duì)相同種毛皮樣品提取的結(jié)果見(jiàn)表1。

通過(guò)對(duì)兩種方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示按方法1提取的結(jié)果有3份樣品滿足1.8≤A260/A280<2.0，按方法2提取的結(jié)果有6份樣品滿足1.8≤A260/A280<2.0；按方法1提取的結(jié)果有6份樣品是不能滿足PCR分析要求的，按方法2提取的結(jié)果有1份樣品是不能滿足PCR分析要求的。本研究中將能夠滿足PCR分析要求的提取結(jié)果判定為DNA提取成功，那么方法1的成功率為40.0%，方法2的成功率為90.0%。如表1所示，10份樣品中，除了7號(hào)和9號(hào)樣品，采用方法1提取的濃度高于采用方法2提取的濃度外，其他8份樣品都是采用方法2提取到的樣品濃度更高。但是根據(jù)7號(hào)和9號(hào)樣品提取的純度來(lái)看，方法2提取的純度高于方法1，在都能提取到DNA的情況下，要優(yōu)先選擇提取純度更高的方法2。

表1 DNA濃度和A260/A280比值測(cè)試結(jié)果

結(jié)合以上分析，方法2的提取效果從濃度和純度兩個(gè)方面考慮要優(yōu)于方法1，這可能是因?yàn)槊ぶ破方咏拥拿刹糠忠灿猩倭緿NA[6]，相對(duì)于毛皮的皮層部分，毛干受到的破壞較小，而方法2中用到的裂解液可以將毛皮樣品上面附著的毛發(fā)完全裂解，釋放出其中的DNA。根據(jù)比較實(shí)驗(yàn)初步確定方法2在毛皮制品的DNA提取方面成功率更高。

3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證方法2的操作性，以及該方法用于不同物種的毛皮DNA提取是否有差異。采用方法2，再對(duì)另外20份來(lái)源于20個(gè)不同物種的毛皮樣品進(jìn)行DNA的提取，有19份樣品DNA提取成功，提取成功率為95.0%。加上前面比較試驗(yàn)的10份樣品，提取成功率為93.3%。因此方法2基本可以滿足對(duì)不同物種的毛皮樣品DNA的提取。

4 結(jié)語(yǔ)

用毛發(fā)裂解緩沖液處理毛皮樣品，然后利用酚氯仿抽提法提取毛皮DNA，能夠獲得較高濃度和純度的毛皮DNA；且提取成功率可達(dá)到93.3%，基本可滿足研究人員對(duì)毛皮制品DNA的進(jìn)一步分析。本研究建立的毛皮DNA提取方法為DNA分析法鑒定毛皮材質(zhì)提供研究基礎(chǔ)，可供毛皮材質(zhì)檢測(cè)人員借鑒參考。

[1] 毛皮工業(yè)術(shù)語(yǔ)：QB/T 1261-1991[S].

[2] 特種動(dòng)物纖維與綿羊毛混合物含量的測(cè)定：GB/T 16988-1997[S].

[3] 鐘 蕾,徐崢琦.動(dòng)物毛皮鑒別方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)纖檢,2012，(7):65-68.

[4] 樸厚坤,趙 晉，李美榮，等.毛皮加工及質(zhì)量鑒定[M].北京:金盾出版社,2009.

[5] 薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002.

[6] 趙春江,李 寧.一種從毛發(fā)中提取DNA的簡(jiǎn)易方法[J].遺傳,2003，25(1):69-70.

Comparative Study of DNA Extraction Methods from Fur

YANG Fang-fang, LUO Li-ling, ZHOU Xiao-fang

(Guangzhou Fiber Product Testing and Research Institute, Guangzhou 510000, China)

By comparing two different DNA extraction methods, the effect of extracting DNA by hair pyrolysis buffer was better than the other method, and it could meet the requirements of the later DNA analysis.

fur; DNA extraction; method

2017-03-29；

2017-04-10

廣東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目(2015CZ16)

楊芳芳(1987-)，女，工程師，碩士研究生，主要從事鞣制皮革/毛皮的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)研究，E-mail：yangfangfang6752@126.com。

TS111.9

A

1673-0356(2017)06-0038-02