基于MOCPs-MWCNTs的大腸桿菌電化學免疫傳感器

楊 華 徐霞紅 郭玉娜 肖英平 唐 標 王 強

(浙江省農業科學院農產品質量標準研究所， 杭州 310021)

基于MOCPs-MWCNTs的大腸桿菌電化學免疫傳感器

楊 華 徐霞紅 郭玉娜 肖英平 唐 標 王 強

(浙江省農業科學院農產品質量標準研究所， 杭州 310021)

食源致病菌引起的食品安全問題已成為全世界關注的焦點。設計了一種基于多壁碳納米管(MWCNTs)-有機配位聚合物(MOCPs)高效固定抗體的大腸桿菌電化學免疫傳感器。利用NaAuCl4與1,4-苯二硫醇(BDT)反應生成金屬有機配位聚合物，同時在BDT的還原作用下生成大量納米金，并包埋大量吸附在MWCNTs表面的大腸桿菌抗體，最終將抗體高效包埋在MOCPs-MWCNTs中，基于MOCPs-MWCNTs固定抗體研制修飾電極，在目標物大腸桿菌O157:H7的存在下，辣根過氧化氫酶標記的抗體(HRP-Ab)隨后特異性捕獲于電極表面形成典型夾心結構，通過HRP催化底物產生電化學信號從而實現大腸桿菌O157:H7的檢測。MOCPs-MWCNTs特有的高比表面積高效固定了大量抗體，增加了傳感器結合抗體的效率并提高了傳感器的靈敏度。該傳感器對大腸桿菌O157:H7的檢測線性范圍為67～6.7×106cfu/mL，最低檢出限為40 cfu/mL。

大腸桿菌O157:H7； 金屬有機配位聚合物； 多壁碳納米管； 電化學免疫傳感器

引言

細菌污染是威脅人類健康的最嚴峻食品安全問題之一[1-2]。在眾多的食源性致病菌中，大腸桿菌O157：H7是危害最大的致病菌之一，可引起嚴重的食源性疾病，甚至導致死亡[3]。傳統的大腸桿菌定量方法如平板計數法大多基于微生物培養技術，通常至少需要2～3 d才能獲得準確結果，難以滿足農產品監管需求。目前，基于聚合酶鏈式反應(PCR)[4]、化學發光[5]、石英晶體微天平(QCM)[6]、酶聯免疫吸附檢測(ELISA)[7]等技術發展了多種大腸桿菌快速檢測方法，但在靈敏度、穩定性、現場監測能力上難以同時滿足需求。因此，迫切需要開發新方法用于高靈敏、高特異性檢測大腸桿菌O157：H7。

免疫測定法是基于抗原與抗體的高特異性識別來實現對抗原或抗體的定量分析方法，由于能避免復雜前處理過程以及具有高靈敏性和特異性響應，被認為是生物分析法和臨床的一個非常強大的工具[8-9]。而電化學免疫傳感器檢測(EIA)憑借檢測速度快、兼容性好、成本低、易小型化等優點引起廣大研究者關注[10]。抗體的固定是決定電化學免疫傳感器性能的關鍵步驟之一，研制高效固定材料，最大量將抗體修飾在電極表面是亟待解決的問題。

金屬有機配位聚合物(MOCPs)是由金屬離子(或金屬氧簇)與有機物配體通過自組裝相互連接構筑具有規則孔道或孔穴結構的框架材料[11]。MOCPs作為一種新型微孔材料，具有豐富的拓撲結構和多孔性[12-13]，近年來，在氣體儲存[14]、化學分離[15]、傳感[16]、催化[17]和藥物釋放與傳送[17-18]等領域廣泛應用。另一方面，碳納米管(CNTs)由于獨特的導電性、高比表面積及強吸附能力，是生物分子高效固定的最佳選擇之一[19-20]。結合MOCPs及CNTs性能，研制高效固定抗體基質材料具有重要的價值。

本文引入高比表面積的多壁碳納米管(MWCNTs)與MOCPs作為抗體固定基質，采用1,4-苯二硫醇(BDT)單體與NaAuCl4配位，快速配位過程中包埋大量吸附在MWCNTs上的抗體，在此基礎上制備大腸桿菌O157：H7抗體修飾電極，以發展更高效靈敏的EIA方法，并研究其在牛奶實際樣品中的應用。

1 原理

圖1為電化學免疫傳感器的構建過程，圖2為構建的傳感器通過HRP催化底物產生的電化學信號圖。MOCPs-MWCNTs固定基質的制備過程如圖1a所示。NaAuCl4與BDT反應生成金屬有機配位聚合物，同時在BDT的還原作用下生成大量納米金，并包埋大量吸附在MWCNTs表面的大腸桿菌抗體，將抗體高效包埋在MOCPs-MWCNTs中。基于免疫傳感技術高靈敏、高選擇性檢測大腸桿菌O157:H7的新型電化學傳感器實驗原理如圖1b所示，制備的MOCPs-MWCNTs修飾于金電極的表面，不僅能夠增強電子傳遞效率，還能夠通過嵌入方式增加捕獲抗體(Ab)的固定效率與穩定性。BSA修飾到電極表面用于封閉未特異性結合位點并減少非特異性吸附。當電極在大腸桿菌O157:H7菌液中孵育后，采用HRP標記抗體(HRP-Ab)再次特異性結合電極表面的大腸桿菌，通過HRP催化檢測底液中的過氧化氫(H2O2)和對苯二酚(HQ)，記錄催化產物對苯二醌的電化學信號從而實現對大腸桿菌的定量檢測。

圖2 傳感器的電化學響應圖Fig.2 Typical DPV responses of biosensor

2 試驗

2.1 儀器及試劑

SU8010型場發射掃描電子顯微鏡,日立高新技術公司；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型場發射透射電子顯微鏡,美國FEI公司；PANalyticalX’Pert PRO型X射線衍射儀,荷蘭PANalytical公司；Primo R型低溫冷凍離心機,美國熱電公司；CHI660E型電化學工作站,上海辰華儀器有限公司；SCILOGEX MX-S型旋渦混合器,美國賽洛捷克公司。

大腸桿菌O157：H7抗體以及辣根過氧化物酶標記的大腸桿菌O157：H7抗體(HRP標記的抗體)購自上海般若生物技術有限公司。大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌O149由北京北納創聯生物技術研究院提供。MWCNTs(長度10～20 μm, 純度95%以上)購于南京先豐納米材料科技有限公司。BDT、HAuCl4·3H2O和HQ購自美國Sigma公司，H2O2、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為分析純，購于上海國藥集團。牛奶購自當地超市。

2.2 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的合成

MWCNTs-MOCPs合成步驟如下：將60 μL(1 mg/mL)MWCNT與60 μL NaAuCl4(0.05 mol/L)于超聲條件下加入至1 mL PBS(pH值7.0)中，攪拌2 h，然后加入600 μL 1 mg/mL BDT和4 mg大腸桿菌O157：H7捕獲抗體。將混合物攪拌10 min 后形成嵌有抗體的MWCNTs-MOCPs復合材料。MOCPs的合成方法除未加入MWCNT外與MWCNTs-MOCPs合成方法一致。最后將所制備的生物復合物懸浮液離心分離，沉淀物洗滌3次，分散在200 μL水中低溫保存。

2.3 傳感器制備

大腸桿菌采用LB培養基(蛋白胨12 g、酵母提取物6 g和NaCl 7 g)培養24 h，將懸浮液貯存于4℃備用。大腸桿菌O157：H7的濃度通過平板計數確定。免疫傳感器的構建使用典型的免疫夾心步驟。6 μL的MWCNTs-MOCPs孵育修飾于電極表面，室溫下干燥2 h后用10 mmol/L的PBS清洗，然后修飾5%的BSA封閉電極，制得MWCNTs-MOCPs修飾電極。

2.4 免疫分析大腸桿菌O157:H7

所制MWCNTs-MOCPs修飾電極表面滴加10 μL不同濃度大腸桿菌O157：H7的溶液，在37℃下孵育60 min后用PBS小心洗滌。隨后將10 μL的0.5 mg/mL HRP標記抗體溶液滴加在電極表面，37℃孵育60 min后經PBS小心洗滌3次，將電極浸入到檢測底液中進行電化學測量。電化學測量采用傳統三電極體系，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為輔助電極，金電極(直徑3 mm)為工作電極。電化學分析方法包括差分脈沖伏安法(DPV)和循環伏安法(CV)均在室溫(20℃)進行。DPV掃描范圍-0.2～0.2 V，底液為含3 mmol/L HQ和1.5 mmol/L H2O2的10 mmol/L PBS(pH值7.4)，脈沖高度為50 mV，階梯高度4 mV，頻率15 Hz。CV掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，底液為含5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]的10 mmol/L PBS。

2.5 實際樣品檢測

為檢驗該傳感器是否可應用于實際樣品檢測，采用牛奶進行驗證實驗，樣品除以PBS稀釋外無其他前處理步驟。均分3份，分別添加6.7×102、6.7×103、6.7×104cfu/mL的大腸桿菌，其余實驗條件保持一致(如2.3、2.4節)。

3 結果與討論

3.1 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的表征

3.1.1 掃描電子顯微鏡(SEM)表征

用SEM表征MOCPs與MWCNTs-MOCPs的微觀形態和結構。如圖3a所示，發現了MOCPs的微觀片狀結構，當電極表面修飾MWCNTs-MOCPs后，可以清晰看到MWCNTs包裹在MOCPs中(圖3b)，這充分證明MOCPs與MWCNTs-MOCPs都已經制備完成。

圖3 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的SEM表征Fig.3 SEM images of MOCPs and MWCNTs-MOCPs

3.1.2 透射電子顯微鏡(TEM)表征

為進一步研究MOCPs與MWCNTs-MOCPs的微觀形態，對其進行了TEM表征，其結果如圖4所示。MOCPs大小分布均勻，可觀察到大量納米金在聚合物內形成(圖4a)。當加入MWCNTs時，MOCPs增加了MWCNTs的管徑厚度，并有大量的納米金和生物聚合物吸附在MWCNTs表面，進一步證明了MOCPs與MWCNTs-MOCPs的成功制備。

圖4 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的TEM表征Fig.4 TEM images of MOCPs and MWCNTs-MOCPs

3.1.3 X單晶衍射(XRD)表征

為研究MOCPs與MWCNTs-MOCPs的結晶情況，對其進行了XRD表征，其結果如圖5所示。圖中2θ表示X射線衍射角度。可以看出XRD譜圖峰型較好，有結晶出現，與金的標準峰相比，MOCPs與MWCNTs-MOCPs都含有金。同時該表征也進一步證明了MOCPs與MWCNTs-MOCPs已成功合成。

圖5 MOCPs與MWCNTs-MOCPs的XRD表征Fig.5 XRD patterns of MOCPs and MWCNTs-MOCPs

圖6 傳感器的CV 和EIS 表征Fig.6 CV and EIS of EIA sensor

3.2 電極組裝的電化學表征

電極表面的層層組裝是傳感器構建的重要步驟，用CV表征了電極的構建過程，如圖6所示。裸金電極(曲線a)出現一對標準氧化還原峰(0.26 mV和0.18 mV)，分別對應了K3[Fe(CN)6]的特征氧化還原峰，當電極修飾了MWCNTs-MOCPs后，氧化還原峰出現微小的降低，可能是由于MWCNTs-MOCPs對電子傳遞效率的促進與抗體對電子傳遞速率阻礙的雙重作用導致的(曲線b)，隨著大腸桿菌O157:H7的修飾，化學信號再次降低，這同時也證明了大腸桿菌已經修飾到電極表面(曲線c)。當HRP-Ab修飾后，可以觀察到生物大分子對電子傳

遞速率的阻礙減小了電化學信號(曲線d)。圖6b描繪了修飾電極過程中相對應的修飾電極交流阻抗(EIS)變化，圖中Z′、-Z″分別表示實部和虛部。裸金電極的阻抗幾乎為直線(曲線a)。而阻抗(半圓的直徑)隨MWCNTs-MOCPs(曲線b)、大腸桿菌(曲線c)、HRP-Ab(曲線d)逐步修飾在電極表面而增大，結果與CV一致。上述結果表明大腸桿菌電化學免疫傳感器已成功制備。

3.3 大腸桿菌檢測

采用該生物傳感器測定一系列不同濃度的大腸桿菌O157:H7。圖7a給出了對于梯度濃度大腸桿菌O157:H7的電化學響應。發現在所測菌體濃度范圍內電化學響應隨大腸桿菌濃度增大而提高，當菌體濃度大于6.7×106cfu/mL時，DPV響應不再隨大腸桿菌濃度增高而增大。且DPV響應與大腸桿菌菌體濃度的對數存在線性關系(圖7b)，關系式為I=3.672lgCE. coli-4.138，線性相關系數為0.997，最低檢測限為40 cfu/mL。

3.4 傳感器性能

圖7 傳感器的標準曲線Fig.7 Calibration curves of EIA sensor

同時采用非目標細菌(如沙門氏菌、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌O149)，研究了此電化學免疫傳感器的特異性。該電化學免疫傳感器對大腸桿菌O157:H7的電流響應值為21.5 μA，而其他菌體的電流響應值均在2.7 μA左右，并未對檢測體系產生明顯的干擾作用，這表明該電化學免疫傳感器對大腸桿菌O157:H7表現出極好的特異性。同時，為探討生物傳感器的重現性，5根相同修飾過程的電極分別用來測定6.7×104cfu/mL大腸桿菌O157:H7，根據檢測結果計算出相對標準偏差為3.73%，表明該電化學免疫傳感器具有很好的重現性。此外還探究了該傳感器的穩定性，5根獨立電極采用相同條件制備，于4℃儲存14 d，檢測最終信號約為最初信號的92%。表明該電化學免疫傳感器具有很好的穩定性。

3.5 實際樣品分析

為進一步考察該傳感器的應用潛力，采用標準添加法，探討了牛奶實際樣品中的檢測性能。將菌體濃度為6.7×102、6.7×103、6.7×104cfu/mL的大腸桿菌O157:H7添加到3個牛奶樣品中，樣品除了PBS緩沖液稀釋沒有更多的預處理。實際樣品的檢測結果如表1所示。該電化學免疫傳感器所得的回收率范圍在94.5%～103.3%之間。此外，將經典的平板計數法與該傳感器的結果進行了對比，差距小于12.4%。上述實驗結果表明該電化學免疫傳感器在實際應用中具有很大的潛力。

表1 實際樣品分析

4 結束語

設計了一個基于MWCNTs-MOCPs高效固定抗體的大腸桿菌O157:H7電化學免疫傳感器。對MOCPs及MWCNTs-MOCPs進行了SEM、TEM、XRD表征，證實了MOCPs及MWCNTs-MOCPs的成功制備。并將此MWCNTs-MOCPs材料用于抗體的固定基質成功修飾在電極表面，制備靈敏的大腸桿菌電化學傳感器，MWCNTs-MOCPs不僅可以加速電極界面上的電子轉移速率，還包埋了大量大腸桿菌O157:H7抗體，提高了抗體修飾效率及穩定性。同時，使用經典夾心型免疫方法，實現了67～6.7×106cfu/mL大腸桿菌的定量測定。此外，該傳感器也被用于分析大腸桿菌O157:H7實際樣品，檢測結果與平板計數法一致。

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Electrochemical Immunosensor Assay (EIA) ofE.coliO157:H7 Based on MOCPs-MWCNTs with Highly Efficient Antibody Immobilization

YANG Hua XU Xiahong GUO Yu’na XIAO Yingping TANG Biao WANG Qiang

(InstituteofQualityandStandardforAgro-products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China)

Microbiological contamination caused by food-borne diseases has become a major public health problem of the world. A novel electrochemical immunosensor assay (EIA) for high sensitive and specific detection ofEscherichiacoliO157:H7 was developed. A new nanocomposites with multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) embedded inmetal-organic coordination polymers (MOCPs) was successfully prepared as highly efficient matrices of capturing antibody immobilization for sensitive electrochemical biosensing. In the presence of targetE.coliO157:H7, horse radish peroxidase (HRP)-labeled antibody was captured on the electrode surface to form a sandwich-type system via the specific identification. As a result,E.coliO157:H7 detection was realized by outputting a redox current from electro-reduction of hydrogen peroxide reaction catalyzed by HRP. In the assay, the combination of the unique properties of MWCNTs and MOCPs can not only accelerate electron transfer on the electrode interface, but also provide an excellent scaffold for the conjugation of capture antibody. Meanwhile, adopting the MWCNTs-MOCPs materials significantly improved the target capturing efficiency and enhanced the sensitivity of the biosensor. The results revealed that the calibration plot obtained forE.coliO157:H7 was approximately linear from 67 cfu/mL to 6.7×106cfu/mL with the limit of detection of 40 cfu/mL. In addition, the biosensor was successfully applied to quantitative assay ofE.coliO157:H7 in synthetic sample (milk). Hence, the developed electrochemical-based immunosensor might provide a useful and practical tool forE.coliO157:H7 determination and related food safety analysis and clinical diagnosis.

EscherichiacoliO157:H7; metal-organic coordination polymers; multi-walled carbon nanotubes; electrochemical immunosensor

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.06.043

2017-04-20

2017-05-03

浙江省自然科學基金項目(LZ15C170001)

楊華(1972—)，男，高級畜牧師，主要從事畜產品質量安全研究，E-mail： yanghua@mail.zaas.ac.cn

TP212.3； TB383

A

1000-1298(2017)06-0328-06