動態高壓微射流對蛋清蛋白致敏性及體外消化的影響

遲玉杰 李胤楠 趙 英

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

動態高壓微射流對蛋清蛋白致敏性及體外消化的影響

遲玉杰 李胤楠 趙 英

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

為研究動態高壓微射流(Dynamic high-pressure microfluidization，DHPM)處理對蛋清蛋白(Egg white protein，EWP)致敏性、消化性的影響，分別選取40、80、120、160、200 MPa壓力對EWP進行處理，通過模擬體內消化過程，測定EWP的水解度和消化率，采用ELISA法測定EWP的致敏性，采用SDS-PAGE、圓二色譜和熒光光譜等技術方法測定EWP結構特性的改變，同時分析EWP表面巰基含量變化。結果表明，80～200 MPa的DHPM處理均可明顯降低EWP的致敏性，尤其在120 MPa條件下，EWP的Ig E結合率降低了63.7%，消化后水解產物的Ig E結合率降低了93.5%。同時，EWP的消化水解效率及蛋白質消化率明顯提高(P<0.05)。在結構特性方面，經DHPM處理(80～200 MPa)的EWP分子量沒有明顯變化，而其表面疏水性和表面巰基含量明顯提高(P<0.05)，熒光強度增強，α-螺旋向β-折疊轉化，表明EWP的致敏性降低及消化性的升高與DHPM處理改變蛋白質原有二級、三級和四級結構特性相關。綜上可知，DHPM處理可以作為一種降低EWP致敏性及提高其消化效率的技術手段。

蛋清蛋白； 致敏性； 體外消化； 動態高壓微射流

引言

蛋清蛋白(Egg white protein，EWP)含有人體所需的8種必需氨基酸，氨基酸組成平衡，是優質的動物蛋白來源。EWP因其豐富的營養價值、易消化吸收的特性以及獨特的功能性質，被廣泛應用于肉腸類、魚糜類及焙烤等食品加工領域[1-2]。但是，EWP的應用仍存在一個關鍵的限制因素——致敏性。雞蛋已被聯合國糧農組織(FAO)認定為八大類主要過敏食物之一，其過敏發生率為1.6%～3.2%，尤其以兒童及嬰幼兒過敏居多。雞蛋過敏會導致腹痛、痙攣、哮喘，嚴重時甚至危及生命[3]。已有文獻證實EWP是雞蛋中的主要過敏原，包括卵類黏蛋白(OVM，Gal d1)、卵白蛋白(OVA，Gal d2)、卵轉鐵蛋白(OVT，Gal d3)和溶菌酶(Lys，Gal d4)等[4]。因此，針對EWP，在維持其良好消化性的同時，尋找合適的技術方法，降低或消除其致敏性，開發低致敏及無致敏的產品具有實際意義。

動態高壓微射流(Dynamic high-pressure microfluidization，DHPM)是一種新興的高壓均質技術，通過高速沖擊、高頻振動、強烈剪切、空穴爆炸、短時處理及連續操作等綜合作用使大分子結構改變，尤其是蛋白質構象的改變，從而改變蛋白的原有特性，如致敏性及消化性[5-7]。ZHONG等[8]研究結果表明采用DHPM處理β-乳球蛋白，當壓力高于80 MPa時其致敏性明顯降低；HU等[9]研究發現，在180 MPa DHPM處理條件下，花生蛋白結構展開，疏水區域暴露，α-螺旋向β-折疊轉化，二硫鍵含量減少，進而致敏性降低。還有學者研究表明DHPM處理后EWP的功能性質得以改善，溶液平均粒度減小，表觀黏度明顯提高[10-11]。然而，目前國內外關于DHPM處理對EWP致敏性及體外消化的相關報道還很少。因此，本文以EWP為研究對象，通過DHPM對EWP進行物理改性，研究不同壓力對EWP致敏性及體外消化的影響，為拓展蛋清加工領域的應用與發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

新鮮雞蛋，市售；Ig E和Ig G ELISA試劑盒(辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase，HRP)標記的羊抗兔Ig G和Ig E抗體)、胃蛋白酶(酶活力400 U/mg以上)、胰蛋白酶(酶活力250 U/mg以上)、OPA(鄰苯二甲醛)、DTNB(5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))、ANS(8-苯胺-1-萘磺酸)，均購自Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

M-110L型微射流高壓均質機，美國Microfluidics公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；J-815型圓二色光譜儀，日本JASCO公司；SHA-B型水浴恒溫振蕩器，常州億通分析儀器制造有限公司；凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；680型酶標儀，美國BIO-RAD公司；F-4500型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.2 樣品處理及制備

將雞蛋經過清洗后打蛋分離蛋清，攪拌20 min，然后用2層紗布過濾得到蛋清液。取80 mL蛋清液在室溫(20℃)下進行微射流均質處理，處理壓力分別為40、80、120、160、200 MPa。處理后的樣品于4℃保存以備用。

1.3 模擬體內消化試驗

1.3.1 模擬體內消化的過程

參照FERRANTI等[12]和MA等[13]的方法并略作修改。取50 mL不同處理的EWP溶液置于三角瓶中，在37℃水浴中振蕩預熱10 min，加入80 mL消化緩沖液(含120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和6 mmol/L CaCl2)，具體消化過程如圖1所示。收集胃消化0 h和1 h以及腸消化2 h樣品，存于-20℃以備用，用來進行EWP水解度和蛋白質消化率的測定。

圖1 EWP模擬體內消化方案圖Fig.1 Scheme of simulating digestion in vitro on EWP

1.3.2 水解度測定

根據PENAS等[14]的鄰苯二甲醛法(OPA)并略作修改。400 μL樣品酶解液加入3 mL OPA試劑，迅速混勻，避光反應2 min，同時以未水解樣做空白對照試驗，于340 nm下測定吸光度，水解度計算公式為

(1)

式中 ΔA——水解樣品的吸光度與未水解樣品吸光度的差值

d——稀釋倍數

c——蛋白質量濃度，g/L

1.3.3 體外消化率測定

采用TCA-NSI(三氯乙酸氮溶指數)法[15]，取10 mL消化液，加入等體積的10% TCA(三氯乙酸)沉淀蛋白，4 000 r/min離心15 min，取上清液，用凱氏定氮法測其中氮的含量，其中空白試驗以蒸餾水代替樣品消化液，蛋白質消化率計算公式為

(2)

式中m1——樣品上清液中氮的質量，gm0——空白上清液中氮的質量，gm2——樣品中蛋白質的質量，g

1.4 致敏性測定

參照JIN等[16]的方法，采用間接酶聯免疫吸附法(ELISA)。將DHPM處理后的EWP溶液及體外消化液稀釋至50 μg/mL(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH值7.4)，取樣品加到100 μL/孔的96孔酶標板中，于4℃靜置12 h；用PBST(含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)洗滌3次，拍干；在酶標板孔內加入含有50 mL/L脫脂牛奶的PBS封閉液，200 μL/孔，37℃恒溫箱中孵育2 h，同上洗滌；將兔抗蛋清蛋白血清(按1∶400稀釋)加入板孔，100 μL/孔，37℃恒溫箱中孵育2 h，同上洗滌；加入HRP標記的羊抗兔Ig E-OVA(1∶1 000稀釋)或HRP標記的羊抗兔Ig G-OVA(1∶15 000稀釋)，100 μL/孔，37℃恒溫箱中孵育2 h，同上洗滌；再加現配制的OPD(鄰苯二胺)底物顯色液，37℃避光顯色20 min；加入50 μL 2 mol/L的H2SO4終止液，用酶標儀于450 nm處，以空白對照孔調零后測定各孔的光密度值(OD值)。

1.5 SDS-PAGE

參照YANG等[17]的方法，略作調整。凝膠制備：分離膠質量分數為12%，濃縮膠質量分數為3%。樣品處理：將各樣品(蛋白質量濃度1 g/L)或Marker與0.01 mol/L上樣緩沖液以1∶1的體積比混合，沸水加熱5 min備用。取20 μL樣品上樣，先70 V電泳30 min，然后120 V穩壓電泳50 min。用考馬斯亮藍R-250染色液(50%甲醇和10%冰醋酸)染色，然后用脫色液(10%甲醇和7%冰醋酸)脫色。脫色完成后，置于凝膠成像系統中拍照并進行分析。

1.6 圓二色譜分析

用JASCO-815型旋光儀測定EWP的遠紫外圓二色譜變化。將處理后的EWP溶液注入0.1 cm厚的橢圓形比色皿中，在25℃和連續充氮的條件下，進行遠紫外區域(190～250 nm)掃描，速度為50 nm/min，光譜間隔0.1 nm，3次累積。由儀器提供的Yang氏參照CD光譜估算EWP的二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲所占的比率。

1.7 表面巰基含量測定

1 mL EWP溶液(1 mg/mL)加入4 mL緩沖液A(每升溶液含10.4 g Tris，6.9 g甘氨酸，1.2 g EDTA，pH值8.0)，再加入0.1 mL Ellman’s試劑(含4 mg/mL DTNB的甘氨酸緩沖溶液)混勻。于室溫避光放置30 min，取上清液在412 nm處測定吸光度，緩沖液為對照。巰基含量的計算以吸光度除以摩爾消光系數13 600 L/(mol·cm)，并以μmol/g的蛋白表示。

1.8 熒光強度和表面疏水性測定

參照馬爽[18]和遲玉杰等[19]的方法稍做修改，用0.02 mol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液稀釋蛋白溶液質量濃度為0.1 g/L，使用熒光分光光度計測定其熒光強度。其中激發波長350 nm，發射波長為360～680 nm，狹縫寬度5 nm。取4 mL上述蛋白濃度樣品加入20 μL的ANS(8 m mol/L)溶液混合均勻作為熒光探針，立即采用熒光分光光度計在370 nm的激發波長和470 nm的發射波長下測定樣品的熒光強度，狹縫為5 nm條件下掃描其熒光強度。以熒光強度對蛋白質濃度作曲線，曲線斜率即為蛋白質分子的表面疏水性。

1.9 數據分析

試驗中所有結果都是3次測定的平均值，計算標準偏差。采用Origin 8.6軟件對數據進行分析與制圖，采用SPSS 20.0軟件進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 DHPM對EWP體外消化水解度及消化率的影響

圖2 DHPM對EWP體外消化水解度及消化率的影響Fig.2 Effect of DHPM on hydrolysis degree and digestibility of EWP

消化率是評價食物營養價值的重要指標之一。如圖2所示，SGF消化1 h后，與未處理組相比，DHPM處理總體上均提高了EWP的水解度，且隨著壓力的升高先增大后降低。經SIF消化2 h后，與未處理組相比，DHPM處理后明顯提高了EWP的水解度。且在120 MPa和160 MPa條件下，其水解度優于其他處理組。從圖2可知，在SGF和SIF消化階段，DHPM處理的EWP消化率與未處理組相比均有顯著提高，其中120 MPa和160 MPa處理后EWP消化率提高最多，最終分別提高了19.4%和16.5%。PLANCKEN等[20]研究高壓處理(500 MPa，10℃)蛋清液(10%)后進行胃腸模擬消化，結果發現蛋清液的消化性明顯增加。MIGUEL等[21]對卵白蛋白(OVA)進行上述相似處理后，OVA的水解度得以提高，同時還釋放了活性肽，尤其在胃蛋白酶消化階段。而當壓力升高至160 MPa和200 MPa，EWP的水解度和消化率略有下降，表明過高的壓力使EWP暴露的疏水基團發生再聚集或聚合形成更穩定的結構。

胃蛋白酶是一種肽鏈內切酶，能水解芳香族氨基酸或部分其它疏水性氨基酸的肽鏈；胰蛋白酶可水解精氨酸和賴氨酸羧基組成的肽鍵，能消化溶解變性蛋白質。研究結果表明，DHPM處理可明顯提高EWP的水解效率及消化率，這說明微射流均質過程中劇烈處理條件破壞了蛋白聚集體及蛋白分子的高級結構，使被包埋的酶解位點暴露，提高蛋白的酶解敏感性進而增強其水解效率，因此EWP的消化率得以提高。已有報道壓力處理可通過使蛋白變性、解折疊或化學鍵破壞而增強蛋白酶與蛋白結合位點的易接近性[22]。

2.2 DHPM對EWP致敏性的影響

本試驗采用ELISA法測定DHPM處理后EWP的Ig G和Ig E結合能力進而測定其致敏性。由表1可知，與原蛋清蛋白相比，DHPM處理后EWP的Ig G致敏性減少，且在120 MPa條件下其致敏性達到最低。SGF和SIF消化后水解產物的Ig G結合能

力也進一步說明了DHPM處理提高了EWP消化性。在高于80 MPa條件下，SGF和SIF消化后水解產物的致敏反應顯著降低，且在120 MPa和160 MPa，其Ig G反應最低。Ig E結合反應的變化趨勢與Ig G相一致，表明DHPM處理(80 MPa以上)可減少能引起過敏的EWP組分，尤其在120 MPa，EWP及消化后水解產物的Ig E結合能力與空白組相比分別下降了63.7%、89.5%和93.5%。本研究中DHPM處理(80 MPa以上)可明顯降低EWP致敏性，研究表明DHPM處理可以破壞EWP的空間結構進而破壞其蛋白的構象表位，使其不能與Ig G或Ig E結合，達到致敏性的效果，本研究結果與ZHONG等[8]研究結論一致。但當壓力達到160 MPa和200 MPa時，EWP的致敏性又略有升高。SATHE等[23]報道當大豆蛋白的處理壓力高到一定程度，其致敏性也略有增加，原因可能是過高的壓力會破壞維持蛋白構象的作用力，使得原本隱藏在蛋白結構內部的抗原表位暴露，增加了與Ig G或Ig E結合的幾率，進而增加蛋白的抗原性。此外，體外消化結束后，水解產物的致敏性仍沒有完全消除，表明消化后的某些肽片段仍具有抗原表位的殘余。

表1 DHPM處理下EWP及其體外消化水解液的致敏性(OD值)

注：同列數據之間的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 DHPM對EWP分子量的影響

圖3 DHPM處理后EWP的分子量分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of DHPM treated EWP

如圖3所示，圖中0表示蛋白Marker，1表示未經處理的EWP，2～6表示不同壓力(40、80、120、160、200 MPa)DHPM處理的EWP。DHPM處理后EWP的電泳行為與原蛋清蛋白相比沒有顯著變化。DHPM處理后并沒有使EWP發生大分子聚集或裂解成小分子，這表明EWP的分子量沒有變化，這與黃群等[24]研究的超高壓處理后S-卵白蛋白的分子量分布結果相一致。ZHONG等[8]和LI等[25]研究高壓處理植物鐵蛋白和大豆分離蛋白后發現，盡管蛋白的三級結構發生改變，但電泳行為與本研究觀察到的結果相似。CHEN等[26]研究結果表明DHPM處理沒有引起大豆蛋白的降解，而是暴露了水解位點及提高了酶解敏感性。

2.4 DHPM對EWP二級結構的影響

將CD圖譜與Yang氏參照CD光譜擬合后估算出EWP二級結構中α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲所占的百分比，如表2所示。隨著處理強度的增大，α-螺旋含量先下降后上升，而β-折疊含量先上升后下降。但與原蛋清蛋白對比，DHPM處理的EWP α-螺旋含量減少而β-折疊含量增多。比如，當壓力處理為120 MPa時，EWP的α-螺旋含量從44.5%降低到31.5%(P<0.05)，而β-折疊含量從10.9%增加至18.6%(P<0.05)。

表2 DHPM處理后EWP二級結構所占百分比

DHPM處理后EWP的一些α-螺旋結構被破壞轉向β-折疊結構，表明EWP的二級結構改變，且改變量與壓力有關，這與HU等[9]研究的DHPM對花生蛋白二級結構的影響和周昊等[27]通過高壓處理后白果蛋白的二級結構變化的結論一致。此外，研究結果顯示二級結構的變化與致敏性降低的趨勢相一致，即致敏性隨α-螺旋含量的減少而降低，表明抗原表位很可能主要位于EWP 的α-螺旋結構內[9]。

2.5 DHPM對EWP表面巰基(—SH)含量的影響

DHPM處理的EWP表面—SH含量變化如圖4所示。通常，二硫鍵對維持EWP的二級和三級結構起著很重要的作用。有研究報道DHPM處理可使蛋白質的二硫鍵裂解轉變成—SH，使得表面巰基含量增加及致敏性降低[9]。本研究中，未經DHPM處理的EWP表面—SH質量摩爾濃度為2.29 μmol/g，隨著壓力增加至120 MPa，其表面—SH含量一直明顯增加，說明二硫鍵的破裂導致新的表面—SH的形成。當壓力為160 MPa和200 MPa時，其表面—SH含量略有下降但不顯著，這可能是因部分新產生的表面巰基不穩定，易相互反應重新形成二硫鍵。

圖4 DHPM對EWP表面巰基含量的影響Fig.4 Effect of DHPM on free sulfhydryl group content of EWP

此外，二硫鍵對蛋白的Ig E或Ig G結合表位的完整性也起著很重要的作用，這與EWP的致敏性關系密切[28]。DHPM處理后EWP的二硫鍵減少并且其致敏性降低，因為含抗原表位的部分是很難被水解的，但是當二硫鍵破壞后這些抗原表位易被胃蛋白酶及胰蛋白酶快速水解消化，進而導致整體致敏性的降低，關于Ara h2(花生蛋白)[9]和β-乳球蛋白[29]的致敏性報道也得到相似的結論。同時，還有一些相關研究報道二硫鍵對維持Ig E或Ig G結合表位的構象很重要[28,30]。因此，可以推測DHPM處理通過改變EWP的構象來降低其致敏性。

2.6 DHPM對EWP熒光強度和表面疏水性的影響

圖5 DHPM對EWP熒光強度和表面疏水性的影響Fig.5 Effect of DHPM on fluorescence intensity and hydrophobicity of EWP

由圖5可知，與未經DHPM處理的EWP比較，其熒光的最大吸收波長λmax為490 nm，并沒有隨著壓力的變化而發生移動，但隨著壓力的增大，EWP的熒光強度明顯增強。當壓力上升至120 MPa時，熒光強度達到最大，但是經更高壓力處理后，熒光強度有所下降。ZHONG等[8]報道了DHPM處理導致β-乳球蛋白相對熒光強度增強，而最大譜峰也沒有發生移動。DHPM處理后EWP的熒光強度增強表明蛋白質結構展開，更多疏水區域暴露，進而EWP疏水性增強，這表明DHPM處理改變了EWP的三級和四級結構。當壓力為160 MPa和200 MPa，EWP相對熒光強度有所減弱，表明暴露的疏水基團再聚集形成更穩定的結構。

從圖5可以看出，EWP的表面疏水性變化與熒光強度變化相一致。隨著處理壓力的增加，EWP的表面疏水性先上升后下降。關于高壓處理導致其他蛋白的表面疏水性增加的報道也很多，結構緊實及含有分子內二硫鍵的球蛋白偏多，比如大豆球蛋白[31]和卵白蛋白[32]等。本研究結果證實EWP結構的改變是因為DHPM與天然EWP結構構造有關。同時，EWP三級結構的改變進一步解釋DHPM處理降低了其致敏性。據報道高壓處理降低了其他致敏蛋白(大豆分離蛋白[25]和α-淀粉酶抑制劑[33])的Ig E結合活性，主要是由蛋白質三級結構改變引起的。

3 結束語

不同的加工處理方式影響食物蛋白的理化性質，相應地影響蛋白的消化性、生物活性和致敏性。本研究的DHPM處理(80～200 MPa)可明顯提高EWP體外水解度及蛋白質消化率，同時EWP致敏性明顯降低，說明DHPM處理明顯提高了EWP的水解效率和脫敏效果，但主要取決于選擇的處理壓力。通過DHPM處理后，EWP的分子量沒有變化，但隨著壓力的增加，其表面巰基含量和表面疏水性整體上高于天然蛋清蛋白，而α-螺旋含量降低，且α-螺旋向β-折疊轉化，這說明DHPM處理使EWP的二級、三級及四級結構發生改變，這些結構的改變與EWP致敏性的降低有著密切關系，即通過破壞蛋白的構象表位使其致敏性降低。因此，DHPM技術可以作為一種降低EWP致敏性及提高消化性的物理改性手段，推薦的適宜壓力為120 MPa左右。本研究為開發低致敏性蛋清蛋白產品，拓寬其應用前景提供了理論基礎。

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Effect of Dynamic High-pressure Microfluidization on Egg White Protein Allergenicity and Digestibility

CHI Yujie LI Yinnan ZHAO Ying

(CollegeofFoodScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

Aiming to investigate the effects of DHPM treatment on allergenicity, digestibility and structures of EWP, EWP was processed under a continuous pressure array of 40 MPa, 80 MPa, 120 MPa, 160 MPa and 200 MPa. After DHPM treatment, the degree of hydrolysis and digestibility of EWP was evaluated by in vitro digestion test, the allergenicity was measured by ELISA assay, and changes in molecular weight and conformational structure of EWP were characterized by SDS-PAGE, circular dichroism spectrum and fluorescence spectra. The results showed that DHPM treatment with pressure ranging from 80 MPa to 200 MPa could significantly reduce the allergenicity of EWP, especially at 120 MPa. The Ig E-binding of DHPM treated EWP and its hydrolysates were reduced by 63.7% and 93.5%, respectively. Meanwhile, the molecular weight distributions of DHPM treated EWP were not changed. However, the DHPM treatment contributed to an increase in relative fluorescence intensity, but the spectral peaks shift was not observed. At the same time, the surface hydrophobicity and free sulfydryl group content of EWP were significantly increased after DHPM treatment (80～200 MPa) compared with native EWP, and some α-helices were destroyed and converted to β-sheets and random coils, indicating that the secondary and tertiary structures of EWP were changed. It was found that the reduction of antigenicity was correlated with the changes in the structure and epitopes of the allergenic protein. Thus the content of α-helices was decreased with the reduction in antigenicity, suggesting that Ig E-binding epitopes might be located in the α-helices structure of EWP. Moreover, hydrolysis efficiency and digestibility in vitro of EWP were markedly increased through the DHPM treatment (80～200 MPa). These results suggested that DHPM can be adopted as an important physical modification method for EWP of hypoallergenic and improving digestibility. The research can provide theoretical basis for the development of low sensitivity egg white products and their applications in food industry.

egg white protein; allergenicity; in vitro digestion; dynamic high-pressure microfluidization

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.06.041

2016-10-18

2016-11-24

國家自然科學基金項目(31470094)和現代農業產業技術體系建設專項資金項目(CARS-41-K25)

遲玉杰(1963—)，女，教授，博士生導師，主要從事食品化學及農畜產品深加工研究，E-mail: yjchi323@126.com

TS253

A

1000-1298(2017)06-0312-07