蘇木乙酸乙酯提取物對心臟移植模型大鼠LFA-1mRNA表達(dá)的影響

史海蛟，楊可鑫

蘇木乙酸乙酯提取物對心臟移植模型大鼠LFA-1mRNA表達(dá)的影響

史海蛟1，楊可鑫2

目的 觀察蘇木乙酸乙酯提取物對同種異位心臟移植急性排斥反應(yīng)模型大鼠移植心肌淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)mRNA表達(dá)的影響，探討其免疫抑制作用的機制。方法 采用改良的Ono術(shù)式，以Wistar大鼠為供體，SD大鼠為受體，制備大鼠同種異位心臟移植模型，造模成功后，采用 Real Time-PCR法測定LFA-1mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與模型對照組相比，蘇木組、CsA組及蘇木加半量CsA組均能明顯抑制LFA-1mRNA的表達(dá)，而蘇木乙酸乙酯提取物及蘇木乙酸乙酯提取物加半量CsA抑制LFA-1 mRNA的表達(dá)的作用相當(dāng)，且在抗排斥反應(yīng)時，蘇木乙酸乙酯提取物可以減少CsA的用量。結(jié)論 在大鼠心臟移植模型中，蘇木乙酸乙酯提取物具有抑制同種異位心臟移植模型大鼠心肌的LFA-1mRNA的表達(dá)，減輕移植心臟的急性排斥反應(yīng)。

蘇木乙酸乙酯提取物；同種異體心臟移植；LFA-1mRNA

隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，同種異位器官移植已經(jīng)是治療終末期疾病器官移植相對有效的方法，而急性排斥反應(yīng)是術(shù)后存活率和成敗最大的障礙之一，有研究證實，移植排斥的效應(yīng)階段主要是宿主免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞大量浸潤攻擊移植物[1]。目前臨床上已經(jīng)應(yīng)用了多種有顯著效果的免疫抑制劑，但其毒副作用很大。因此，現(xiàn)在最主要的任務(wù)是如何使急性排斥的嚴(yán)重程度大幅度降低，尋找高效低毒、廉價的免疫抑制劑，是非常必要的。蘇木為傳統(tǒng)中藥，具有祛瘀通經(jīng)、活血療傷的功效。文獻有關(guān)于蘇木功效的記載。《唐本草》首載：“主破血”。《大明》 ：“消臃腫，撲損淤血，排膿止痛”。在器官移植術(shù)后發(fā)生的急性排斥反應(yīng)的主要病理表現(xiàn)是在受體血管與供體血管血流開通后數(shù)分鐘內(nèi)，供體血管迅速出現(xiàn)血栓形成，這與中醫(yī)學(xué)的血瘀癥較相似。中醫(yī)治法則為活血化瘀。因此，蘇木則應(yīng)用于免疫抑制作用的研究。淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)是整合素家族中的一個成員，是細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)的配體，能增強細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)黏附分子參與排斥反應(yīng)中免疫系統(tǒng)的激活，阻斷黏附分子活性能明顯延長移植物的生存時間。因此，本文研究旨在通過建立大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)模型，觀察蘇木乙酸乙酯提取物對同種異位心臟移植急性排斥反應(yīng)模型大鼠移植心肌LFA-1mRNA表達(dá)的影響，探討其免疫抑制作用的機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及樣品采集

1.1.1 實驗動物 受體：健康、清潔級SD大鼠，雄性，體重(220±20)g。供體：健康、清潔級Wistar大鼠，雄性，體重(220±20)g。均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗用藥 蘇木乙酸乙酯提取物：蘇木粗粉(80目)加入 75%乙醇回流提取2 h，提取液減壓回收乙醇，濃縮至膏狀，減壓干燥，得到干粉。將蘇木乙醇提取干粉倒入雙蒸水進行混懸，并用乙酸乙酯萃取、回收，從而獲得蘇木乙酸乙酯提取物。環(huán)胞素A(CsA)：將每粒含CsA 25 mg的環(huán)孢素軟膠囊(田可)溶解于橄欖油中，將其配制成3.5 mg/mL濃度的藥液，于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 心臟移植模型的制備 大鼠同種異位心臟移植術(shù)，采用經(jīng)改良的Ono術(shù)式，將供心的升主動脈與受體的腹主動脈，供心的肺動脈與受體的下式，將供心的升主動脈與受體的腹主動脈，供心的肺動脈與受體的下腔靜脈分別吻合，為供心提供血液循環(huán)。

1.1.4 實驗分組 大鼠隨機分為4組，每組8只。設(shè)為模型對照組、蘇木組、CsA組、蘇木加半量CsA組。術(shù)后每天09：00灌胃給藥，每天1次，模型對照組每天按10 mL/ kg灌服橄欖油，蘇木組給予蘇木乙酸乙酯提取物736 mg/kg溶于橄欖油后灌服給藥，CsA組給予按35 mg/kg溶于橄欖油后灌服給藥，蘇木加半量CsA組給予蘇木乙酸乙酯提取物736 mg/kg加CsA 17.5 mg/kg溶于橄欖油后灌服給藥，各組均以同體積橄欖油給大鼠灌胃。

1.1.5 標(biāo)本的采集 術(shù)后大鼠腹腔移植心跳滿7 d者于當(dāng)天取供心；不滿7 d者于腹腔心臟停跳時取供心。移植心臟存活時間以天為計算單位，手術(shù)當(dāng)天按0 d計算，不足24 h者采用四舍五入法計算。術(shù)后第7天，給藥2 h后，將受體大鼠用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg體重)麻醉，常規(guī)固定、消毒、鋪巾處理。沿正中線切開腹壁，剝離出下腔靜脈。快速用手術(shù)剪(0.1 %DEPC 水處理后)剪取供心心肌組織，標(biāo)本分為兩份：一份剪碎后置入凍存管中，迅速置于液氮罐中冷凍，-80 ℃低溫冰箱保存，待做Real-Time PCR檢測用。

1.2 Real Time PCR測定LFA-1mRNA

1.2.1 總RNA的提取 提取RNA按照美國QIAGEN公司RNeasy@ Mini Kit試劑盒的說明進行操作：取樣品100 mg放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨，將粉末移入1.5 mL EP管中，加入450 μL Buffer RLT；將樣品轉(zhuǎn)移至2 mL體積的RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心15 s，棄上清。然后加700 μL Buffer RW1到RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心15 s，棄上清。再加500 μL Buffer RPE到RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心15 s，棄上清。加500 μL Buffer RPE到RNeasy column中，大于8 000 g/min，離心2 min。將RNeasy column移至一新的2 mL EP管中，10 000 g/min，離心1 min。將RNeasy column移至一新的1.5 mL EP管中加入30 μL～50 μL RNase-free水，大于8 000 g/min，離心1 min。棄柱子，溶液-20 ℃保存。將取提取的Total RNA，用紫外分光光度計檢測在260 nm和280 nm下的OD值，260 nm/280 nm 的比值應(yīng)在1.8～2.0范圍內(nèi)。小于1.8說明有蛋白污染，大于2.0則可能有機溶劑污染。

1.2.2 引物設(shè)計(見表1)

表1 引物設(shè)計

1.2.3 純度驗證 將提取的RNA進行甲醛變性凝膠電泳，對其純度加以驗證，方法如下：電泳槽用0.3%H2O2浸泡30 min，0.1%的DEPC水沖洗晾干后鋪膠(20 mL)∶1.2%的瓊脂糖0.24 g，無RNase水17.4 mL，10×MOPS 2.0 mL，37%甲醛0.6 mL，DNA Green 1.0 μL將瓊脂糖加水融化后，加10×MOPS，待膠冷卻至60°C左右，再加甲醛和DNA Green。加入2.0 mL甲醛凝膠上樣緩沖液(10×)進行上樣和電泳：穩(wěn)壓7.5 V/cm電泳。

電泳液為1×MOPS電泳緩沖液。直至溴酚藍(lán)遷移至膠下游的3/4處時，結(jié)束電泳，在紫外投射儀下，測量28S rRNA和18S rRNA至加樣孔的距離，用來確定RNA的完整性。完整的總RNA樣品應(yīng)出三條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA條帶的亮度應(yīng)為18S rRNA條帶亮度的3倍左右，這表明總RNA樣品比較完整，基本無降解。1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照TaKaRa PrimeScript ? RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進行操作。

1.2.5 Real Time PCR 反應(yīng) 使用SYBR?Green I嵌合熒光法檢測各組基因的表達(dá)。按Power SYBR? Green PCR Master Mix： Performing Real-Time PCR Assays(For Applied Biosystems，ABI 7500，Invitrogen Tech-Line SM U.S.A. PN 4367218)和ROX Reference Dye (Invitrogen Tech-Line SM U.S.A. Cat. No. 12223-012)試劑盒的組分配制Real-time PCR反應(yīng)液(在冰上進行反應(yīng)液配制)

1.2.6 計算方法 在60 ℃、60 s步驟收集信號，調(diào)整最佳閾值，獲得Ct值；同時對Real-time PCR產(chǎn)物進行SYBR融解曲線分析，并用滅菌的去離子水代替模板作為陰性對照。以β-actin 作為內(nèi)參照，用相對定量法2-ΔΔCt分析mRNA相對表達(dá)量。ΔΔCt=[對照組目的基因平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值]-[待檢樣品目的目的基因平均Ct值-待檢樣品看家基因平均Ct值]。

2 結(jié) 果

從溶解度曲線可見看出，溶解曲線只有一個峰，說明PCR擴增特異性良好(見圖1)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出，β-actin和LFA-1mRNA擴增效率基本一致，說明結(jié)果可靠(見圖2)。以模型對照組大鼠作為對照，其LFA-1mRNA表達(dá)量為1，隨著藥物的干預(yù)，各治療組LFA-1mRNA表達(dá)降低，與模型對照組比較，各治療組均能明顯抑制LFA-1mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與CsA組比較，蘇木組作用效果較差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而蘇木加半量CsA組作用效果相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

圖1 Real Time-PCR擴增基因β-actin和LFA-1的溶解曲線

圖2 Real Time-PCR擴增基因β-actin和LFA-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 移植心肌組織LFA-1mRNA相對表達(dá)(±s)

3 討 論

LFA- 1 最初是在CTL介導(dǎo)靶細(xì)胞殺傷實驗中發(fā)現(xiàn)的，功能與CTL相關(guān)的膜蛋白分子。LFA-1屬于整合素家族的一類黏附分子，能表達(dá)于淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等表面，與細(xì)胞內(nèi)黏附分子ICAM(1-3)結(jié)合(其中LFA-1與ICAM-1結(jié)合力最強)，引起細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附、游走及吞噬等功能[2]。牛堅等[3]研究認(rèn)為，VCAM-1參與單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞向炎癥部位浸潤和NK細(xì)胞黏附與遷移，異種肝移植急性排斥反應(yīng)時，LFA-1mRNA表達(dá)明顯升高，VCAM-1的表達(dá)明顯升高。若能明顯抑制異種肝移植排斥反應(yīng)中LFA-1mRNA的表達(dá)，則可有效抑制移植排斥反應(yīng)。研究表明，LFA-1mRNA參與中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附并穿越血管內(nèi)皮過程，參與T淋巴細(xì)胞的活化過程，并可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的分泌[4]。而介導(dǎo)白細(xì)胞向移植部位的浸潤是LFA-1mRNA參與排斥反應(yīng)發(fā)生的機制之一，而且能啟動T淋巴細(xì)胞的黏附和活化，攻擊帶有移植物抗原的靶細(xì)胞，增強急性排斥反應(yīng)程度[5]。此外，還有研究表明，阻斷LFA-1mRNA的結(jié)合位點可抑制移植排斥反應(yīng)。而動物體內(nèi)實驗[6]的研究表明，LFA-1mRNA單克隆抗體能明顯延長移植鼠的生存期，并且能顯著降低急性移植物抗宿主(graft-versus-host disease，GVHD)的發(fā)生。Dedrick 等[7]在腎移植方面的研究得到相似結(jié)果。歐洲多中心開展的Ⅱ期臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用LFA-1 mRNA抗體阻斷LFA-1/ICAM-1協(xié)同刺激信號雖然可降低GVHD的發(fā)生率，提高移植成功率，但同時造成了持續(xù)免疫抑制，增加嚴(yán)重感染率和白血病復(fù)發(fā)率，致使人類白細(xì)胞抗原(HLA)不相合異基因造血干細(xì)胞移植的遠(yuǎn)期生存率無明顯增加[8]。

本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，蘇木組和CsA均能降低移植心肌中LFA-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)。蘇木加半量CsA組對LFA-1mRNA的降低作用好于蘇木組，略低于CsA組，但二者無明顯差異。因此，一方面說明LFA-1mRNA參與了SD大鼠的心臟移植排斥反應(yīng)；另一方面也更進一步說明蘇木是通過調(diào)節(jié)LFA-1mRN發(fā)揮的作用，而在抗排斥方面，蘇木可減少CsA的用量。可見，蘇木乙酸乙酯提取物能明顯改善術(shù)后大鼠的一般狀態(tài)，其作用機制可能與蘇木乙酸乙酯提取物能抑制LFA-1mRNA的表達(dá)有關(guān)，但其抗免疫排斥作用的另一些機制還有待進一步研究。

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(本文編輯郭懷印)

國家重大科技專項(No.2009ZX09103-425)

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(沈陽110032)，E-mail：80670335@163.com；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)

信息：史海蛟，楊可鑫.蘇木乙酸乙酯提取物對心臟移植模型大鼠LFA-1mRNA表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(10)：1183-1186.

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.10.010

1672-1349(2017)10-1183-04

2017-01-06)