西蘭花莖葉多肽的酶法提取及其增強免疫力功能研究

黨亞麗,么春艷,周亭屹,俞 盈,李青青,吳慶其

(浙江省醫(yī)學科學院,浙江杭州 310013)

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西蘭花莖葉多肽的酶法提取及其增強免疫力功能研究

黨亞麗,么春艷,周亭屹,俞 盈,李青青,吳慶其

(浙江省醫(yī)學科學院,浙江杭州 310013)

本文對西蘭花莖葉多肽進行酶法提取以篩選增強免疫力功能活性強的組分。從西蘭花莖葉中提取粗蛋白后,首先經(jīng)酶法制備西蘭花多肽,然后采用Valflow50超濾、Sephadex G-15進行分離純化,得到分子量為310～2600 Da的西蘭花小肽,并對其進行增強免疫力功能的動物實驗研究,分別以100、50、25 mg/kg·bw 3個劑量的西蘭花多肽提取物對小鼠連續(xù)灌胃30 d,然后分別測定小鼠的體液免疫功能、細胞免疫功能和單核-巨噬細胞功能。結果表明,高劑量組(100 mg/kg)西蘭花多肽提取物對小鼠的淋巴細胞轉化能力(0.225± 0.040)與小鼠的左右耳片重量差異(18.19±2.94) mg均顯著高于空白對照組(p<0.05)。西蘭花多肽提取物對正常小鼠碳粒廓清功能有非常明顯的促進作用,碳廓清指數(shù)分別為(0.126±0.052)和(0.136±0.022),高、中劑量能顯著(p<0.05)增加小鼠非特異免疫功能。以上結果表明西蘭花多肽提取物具有增強免疫力的功能,此研究可為西蘭花的深度開發(fā)和綜合利用提供基礎數(shù)據(jù)和科學參考。

西蘭花,多肽,提取,增強免疫力

西蘭花(BrassicaoleraceaL.var.botrytisL)又名青花菜,為十字花科蕓薹屬二年生植物,被譽為“蔬菜皇冠”,內(nèi)含豐富的生物活性物質(zhì),其中包括蘿卜硫素、多糖等抗腫瘤活性物質(zhì)和多酚、黃酮等多種抗氧化活性物質(zhì),此外蛋白和氨基酸含量也較高,具有非常高的食用和藥用保健價值[1]。

國外已有研究證明蘿卜硫素具有增強免疫力功能[2]。美國《營養(yǎng)學》雜志也刊登了西蘭花能有效預防前列腺癌的研究成果[3]。Shapiro TA[4]等人通過臨床實驗比較了西蘭花芽提取物中的葡糖異硫氰酸鹽、蘿卜硫苷以及萊菔硫烷異硫氰酸鹽的安全性、耐受性及在體內(nèi)的代謝。周向軍[5]等報道從Broccolini(西蘭花與中國芥蘭的雜交品種)葉中提取的黃酮可抑制人類腫瘤細胞株SW480、HepG2、Hela和A459等增殖,并能誘導SW480細胞株凋亡,但有關將西蘭花多肽分離增強免疫力方面的研究鮮見報道。

具有強化人體免疫功能的多肽應用于臨床,如胰島素、生長激素、釋放抑制素Somatostatin、腦活素多肽疫苗等。榮建華等[6]研究了大豆多肽對小鼠免疫功能的影響,結果表明大豆多肽能顯著增加小鼠免疫器官的重量,增強機體非特異性免疫功能,還有證據(jù)表明大豆多肽可防治腫瘤,對腫瘤的生長有一定的抑制作用[7]。

免疫力低下已成為當今社會人們?nèi)找嬷匾暤慕】祮栴},研究和發(fā)現(xiàn)那些可增強人體免疫力,防止疾病發(fā)生的食品和保健品也是目前研究的熱點之一,對西蘭花活性多肽進行分離純化,并進行增強免疫力功能的研究,可為西蘭花的精深加工和開發(fā)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮西蘭花莖葉 浙江省臺州天萊生物技術有限公司；Sephadex G-15 sigma公司;堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG novozymes公司；實驗動物 實驗選用清潔級健康ICR小鼠,體重18～22 g,單一雄性,浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)證許可證號SCXK(浙)2014-0001。飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心SPF級動物房,實驗條件保持溫度為25 ℃,相對濕度為40%～70%,光照-黑暗循環(huán)為12 h∶12 h,自由飲水攝食；RPMI1640、FBS、Hank’s液、ConA、MTT、異丙醇、HCl、DNFB、丙酮、麻油、生理鹽水、印度墨汁、Na2CO3。

Sartorius vivaflow 50回旋流/切向流超濾器 德國賽多利斯公司;FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司;Waters600高效液相色譜儀 配2487紫外檢測器和M32工作站，美國Waters公司;UV-1700型紫外可見分光光度計 日本島津;SartoriusRSA224S型電子天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司;Pellicon? 2 mini Cassette(Millipore Corporation)、HD-3型紫外檢測器、BSZ-100型自動部份收集、HL-2型恒流泵 上海滬西分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 西蘭花莖葉中蛋白的提取 以西蘭花新鮮莖葉為原料進行壓榨,所得汁液進行加熱,溫度為90 ℃,保溫10 min,沉淀物經(jīng)離心,干燥,即得西蘭花蛋白粉(蛋白質(zhì)含量為4.1%)。

1.2.2 西蘭花莖葉中多肽提取物的酶法制備 以西蘭花蛋白粉為原料,按料液比1︰20加入蒸餾水,在溫度60 ℃、pH8.0條件下,加入2.0%的Acalase堿性蛋白酶,酶解3 h后,滅酶,冷卻,并經(jīng)離心,旋轉蒸發(fā),濃縮后冷凍干燥,得到西蘭花多肽提取物備用[9]。

1.2.3 西蘭花多肽含量測定 采用Folin酚法[10]。

1.2.4 西蘭花多肽提取物的相對分子質(zhì)量分布 凝膠過濾色譜法測定[11]。取凍干樣品,用高效液相色譜儀進行測定,具體條件為:色譜柱:TSK gel 12000 SWXL 300 mm×7.8 mm;流動相:乙腈/水/三氯乙酸45/55/0.1(V/V);檢測器:220 nm;流速:0.5 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣體積:10 μL。用GPC數(shù)據(jù)處理軟件,將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進行計算,即可得到樣品的肽相對分子質(zhì)量及其分布范圍,用峰面積歸一化法可計算出不同分子量范圍肽的近似百分含量。

在TSKgel2000 SWXL體積排阻色譜柱上,以乙腈/水/三氯乙酸(44/55/0.1,V/V)為洗脫劑,以細胞色素C(MW12,500 Da)、抑肽酶(MW6,500 Da)、桿菌酶(MW1,450 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451 Da)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189 Da)為相對分子質(zhì)量標準品。標準曲線的回歸曲線方程為:lgMW=7.20-0.230T,相關系數(shù)R=0.9953,表明各相對分子質(zhì)量對數(shù)與各標樣的洗脫時間呈較好的線性關系,得到西蘭花多肽提取物的相對分子質(zhì)量分布。

1.2.5 西蘭花多肽提取物的初步純化實驗 西蘭花多肽提取物進行超濾(MW<5000 Da),然后用G-15凝膠柱分離,洗脫條件為:洗脫液為去離子水,流速15 mL/h,上樣量100 mg,重復收集三個西蘭花小肽分離組分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,經(jīng)過濾,蒸干,并多次收集干燥備用。

1.2.6 西蘭花多肽提取物增強免疫力功能的動物實驗

1.2.6.1 動物分組與給藥劑量 實驗動物根據(jù)體重隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三個大組,每大組40只小鼠。其中Ⅰ組小鼠進行ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化;Ⅱ組小鼠進行耳廓腫脹實驗;Ⅲ組小鼠進行小鼠碳廓清實驗。每大組40只小鼠分成空白對照組(蒸餾水,10 mL/kg·bw)、西蘭花多肽提取物組(100、50、25 mg/kg·bw)3個劑量組,每組10只。各組小鼠每天灌胃1次,灌胃量0.1 mL/10 g·bw,空白對照組給予同等體積蒸餾水,連續(xù)灌胃30 d后測定各項增強免疫力功能指標。

1.2.6.2 實驗方法 臟/體比值測定、細胞免疫功能測定包括ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗-MTT法和二硝基苯(DNFB)誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)-耳腫脹法及其單核-巨噬細胞功能測定-小鼠碳廓清實驗均參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與技術評價規(guī)范》(2003)進行[12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 西蘭花多肽提取物的相對分子質(zhì)量分布

由圖1、表1可知，西蘭花多肽提取物中的肽相對分子質(zhì)量主要分布在1000 Da以下,此條件下小肽含量為89.41%,說明酶解對西蘭花蛋白粗提物的水解程度很大,已經(jīng)將大部分的西蘭花蛋白質(zhì)水解成小肽及氨基酸,下一步選用凝膠柱G-15進行進一步分離。

圖1 西蘭花多肽提取物的分子質(zhì)量分布 Fig.1 Proportion of different molecular weight of peptide in broccoli注:圖中標注的數(shù)據(jù)為分子量。

2.2 西蘭花多肽提取物的分離純化

用超濾和凝膠柱G-15對西蘭花多肽提取物進行進一步分離純化,結果如圖2。經(jīng)分離純化后得出3個含量相對較高的組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),下一步擬對其進行收集與純化、功能評價及其結構鑒定。

表1 西蘭花多肽提取物的不同相對分子質(zhì)量及其相對含量Table 1 Proportion of different molecular weight of peptide in broccoli

表2 西蘭花多肽提取物對小鼠免疫器官臟/體比值的影響(x±s)Table 2 Effect of polypeptide extract in broccoli on the ratio of immune organs and body weight in mice

注:多組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),*p<0.05,**p<0.01,與空白對照組比較,表3、表4同。

表3 受試物對Con A誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化及遲發(fā)性變態(tài)反應(DTH)Table 3 Effects of splenic lymphocyte transformation and delayed allergic reaction induced by Con A in mice

圖2 西蘭花小肽凝膠柱G-15分離結果Fig.2 Purification result of Sephadex G-15 for taste-active peptide of broccoli

2.3 西蘭花多肽提取物增強免疫力功能動物實驗結果

2.3.1 西蘭花多肽提取物對小鼠免疫器官臟器/體重比值的影響 由表2可知,50 mg/kg西蘭花多肽提取物(酶解粗提物)能顯著增加小鼠脾重。脾系數(shù)與空白對照組相比,具有顯著性差異(p<0.05),而高(100 mg/kg)、低(25 mg/kg)兩個劑量組對小鼠脾系數(shù)無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。三個劑量對小鼠胸腺系數(shù)沒有明顯影響,與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。

2.3.2 西蘭花多肽提取物對細胞免疫的影響 由表3可看出,西蘭花多肽提取物高劑量組(100 mg/kg)對小鼠的淋巴細胞轉化能力與小鼠的左右耳片重量差異均顯著高于空白對照組(p<0.05),中、低劑量組與空白組比較差異不顯著。結果表明西蘭花多肽提取物具有促進小鼠淋巴細胞增殖、轉化能力的作用,能顯著增強DNFB誘導的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的作用。

表4 西蘭花多肽提取物對小鼠碳粒廓清能力的影響Table 4 Effect of polypeptide extracts in broccoli on blood carbon clearance ability in mice

2.3.3 西蘭花多肽提取物對單核-巨噬細胞免疫的影響 由表4結果顯示,與正常對照組相比較,西蘭花多肽提取物對正常小鼠碳粒廓清功能有非常明顯的促進作用,高、中劑量能顯著(p<0.05)增加小鼠非特異免疫功能。

綜上所述,西蘭花多肽提取物在小鼠脾淋巴細胞轉化能力、小鼠左右耳腫脹度差、小鼠碳廓清實驗中,結果與空白對照組相比具有顯著差異,說明西蘭花多肽提取物具有增強免疫力的功能。

3 討論

免疫力低下就是防御疾病能力的減弱。人之所以能在各種環(huán)境中健康地生存,人體免疫系統(tǒng)起著決定性的作用。現(xiàn)如今,約有萬分之一左右的人,由于營養(yǎng)不良等多種因素引起免疫力降低,使得免疫活性細胞不能識別突變細胞,使其生長繁殖,最后發(fā)展成為癌癥。增強免疫力已成為當今人們?nèi)找嬷匾暤囊粋€保健問題。

本研究采用生物酶解技術,得到西蘭花多肽提取物,經(jīng)動物實驗證實其具有增強免疫力功能,下一步將從西蘭花莖葉蛋白多肽提取物中篩選出增強免疫力效果較好的小肽組分,從而鑒定其組成,此研究可為西蘭花的深度開發(fā)和綜合利用提供基礎數(shù)據(jù)和科學參考。

4 結論

本研究通過采用煮沸法提取西蘭花莖葉蛋白后,對其進行酶解,得到西蘭花多肽提取物,接著對西蘭花多肽提取物用超濾、Sephadex G-15分離純化得到肽含量相對較高的組分。

經(jīng)動物實驗表明西蘭花多肽提取物具有增強免疫力功能。

[1]Latte KP,KEAppel,A Lampen. Health benefits and possible risks of broccoli - an Overview[J]. Food Chemistry Toxicology,2011,49(12):3287-3309.

[2]Fernández-León MF,Fernndez-León A M,Lozano M,et al. Altered commercial controlled atmosphere storage conditions for ‘Parhenon’ broccoli plants(BrassicaoleraceaL. var. italica). Influence on the outer quality parameters and on the health-promoting compounds[J]. LWT-Food Science and Technology,2013,50(2):665-672.

[3]Murugan SS,P Balakrishnamurthy,YJ Mathew. Antimutagenic effect of broccoli flower head by the ames salmonella reverse mutation assay[J]. Phytotherapy Research,2007,21(6):545-547.

[4]Shapiro TA,JW Fahey,KL Wade,et al. Chemoprotective Glucosinolates and isothiocyanates of Broccoli Sprouts:metabolism and excretion in humans[J]. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention,2001,10(5):501-508.

[5]Baenas N,DA Moreno,C García-Viguera. Selecting sprouts of brassicaceae for optimum phytochemical composition[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(45):11409-11420.

[7]Fernández-León MF,Fernández-León A M,Lozano M,et al. Retention of quality and functional values of broccoli ‘Parthenon’ stored in modified atmosphere packaging[J]. Food Control,2013,31(2):302-313.

[8]Okada Y,M Okada,Y Sagesaka. Screening of dried plant seed extracts for adiponectin production activity and tumor necrosis factor-alpha inhibitory activity on 3T3-L1 adipocytes[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2010,65(3):225-232.

[9]Chaudhary A,Rampal G,Sharma U,et al. Anticancer,antioxidant activities and GC-MS analysis of glucosinolates in two cultivars of broccoli[J]. Molecular Sciences,2012:30-37.

[10]姜錫瑞,段鋼. 新編酶制劑實用技術手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2003:412-417.

[11]Bahadoran Z,et al. Broccoli sprouts powder could improve serum triglyceride and oxidized LDL/LDL-cholesterol ratio in type 2 diabetic patients:A randomized double-blind placebo-controlled clinical trial[J]. Diabetes Research and Clinical Practice,2012,96(3):348-354.

[12]王光亞. 保健食品檢驗與技術評價規(guī)范[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,2003.

Immunomodulatory effects of the enzymatic extract polypeptide from broccoli stems and leaves

DANG Ya-li,YAO Chun-yan,ZHOU Ting-yi,YU Ying,LI Qing-qing,WU Qing-qi

(Institute of Health Food of Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,China)

The polypeptide extract was gained by enzymatic method from broccoli stems and leaves and its immunomodulatory effects had been studied. The crude protein was extracted from broccoli stems and leaves,and then the broccoli polypeptides were prepared by enzymatic methods. The hydrolysate was isolated by the method of ultrafiltration and Sephadex G-15. The molecular mass of the oligopeptide was 310～2600 Da. The animal experiments were studied on their immunity function. Oligopeptide were consecutively orally given to mice with the doses of 100,50,25 mg/kg·bw(comparatively as 20,10,5 times of recommended human daily dosage)for 30 days. It was determinated for the humoral immune function,the cellular immune function and the mononuclear macrophage function in mice. Results showed that the high dose group(100 mg/kg)of broccoli peptide extracts had high conversion ability(0.225+0.040)and the ear weight were different(18.19+2.94) mg,it was significantly higher than that of control group(p<0.05). Broccoli polypeptide extracts have obvious effect on the normal mice carbon clearance function,carbon clearance index were(0.126+0.052)and(0.136+0.022),high and medium dose significantly(p<0.05)increased the nonspecific immune function of mice. Results showed that the broccoli polypeptide extract could enhance immunity function,which could provide basic data and the scientific reference for the deep development and comprehensive utilization of broccoli.

broccoli;polypeptide;extraction;enhancing immunity function

2016-11-21

黨亞麗(1978-)，女，博士，副研究員，研究方向：生物活性物質(zhì)與保健食品研發(fā)，E-mail:dangyali1978@126.com。

浙江省重大科技計劃項目(2014C02023)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項目(201473497)。

TS252.54

A

1002-0306(2017)11-0352-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.060