藍莓皮渣花色苷抑菌活性及抑制癌細胞增殖作用研究

陳柯斐,王鴻飛,王春幸,熊 茜,宋佳敏,程佑聲,許 鳳

(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)

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藍莓皮渣花色苷抑菌活性及抑制癌細胞增殖作用研究

陳柯斐,王鴻飛*,王春幸,熊 茜,宋佳敏,程佑聲,許 鳳

(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)

以乙醇為溶劑從藍莓果皮中提取得到藍莓皮渣花色苷,采用高效液相色譜分析藍莓皮渣花色苷組分,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌三種細菌為代表,用牛津杯法考察其抑菌效果,初步確定藍莓皮渣花色苷的抑菌譜,采用兩倍稀釋法確定其最低抑菌濃度。采用MTT法檢測不同質量濃度花色苷抗結腸癌、胃癌、肝癌細胞增殖活性。藍莓皮渣花色苷對三種細菌都有抑制作用,其MIC分別為0.63、0.63、1.25 mg/mL。藍莓皮渣花色苷對三種癌細胞都具有一定的抑制率,其抑制結腸癌、胃癌、肝癌的IC50分別為7.54、13.34、21.05 μg/mL。藍莓皮渣花色苷甘具有一定的抑制細菌和癌細胞增殖的效果,對于開發研制新型抗癌藥物具有重要的理論和實際意義。

藍莓皮渣,花色苷,腫瘤,抑菌活性

藍莓(Blueberry)屬于杜鵑花科(Ericaceae),越橘屬(Vacciniumspp.),又名越橘,為多年生落葉或常綠灌木[1]。藍莓富含多種營養成分,有“漿果之王”的美譽。除了含常規的有機酸、糖以外,還富含多種維生素、超氧化物歧化酶(SOD)、不飽和脂肪酸、礦物質等成分,以及花色苷等特殊成分,其中果皮中含有大量的生物活性成分,尤其是花色苷的含量特別高[2]。研究表明,花色苷是一種由花青素和糖以糖苷鍵結合成的水溶性生物活性物質,屬于黃酮類化合物,具有較多的生理活性功能,包括抗氧化及消除自由基、降低血清及肝臟中的脂肪含量、促進視紅素再合成、提高免疫力、增強心臟功能、延緩衰老、抗炎癥及抗腫瘤等多種生理活性功能[3-5]。癌癥是世界上死亡率極高的疾病,但許多研究都表明日常食用的蔬菜和水果中富含的花色苷類化合物可以起到預防癌癥和抑制腫瘤細胞增殖的功效[6]。近年來,植物活性成分的抑菌作用受到廣大學者的廣泛重視并取得較大進展,如黃酮、花青素等酚類物質的殺菌作用被發現。花色苷作為黃酮類化合物,已報道證實具有抑菌作用[7]。目前對藍莓資源的研究主要集中在鮮果的貯藏保鮮及果汁、飲料的加工,對加工剩余的藍莓皮渣的綜合利用研究較少。

本研究采用溶劑浸提法提取藍莓皮渣中的花色苷,采用高效液相色譜分析藍莓皮渣花色苷組分,選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌三種細菌為代表,采用牛津杯法考察其抑菌效果,初步確定藍莓皮渣花色苷的抑菌譜,采用兩倍稀釋法確定其最低抑菌濃度,用MTT法檢測不同質量濃度花色苷抗結腸癌、胃癌、肺癌和肝癌細胞增殖活性,以進一步揭示藍莓皮渣花色苷的抗腫瘤作用機理。實驗為進一步研究藍莓皮渣花色苷的生理活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓皮渣 浙江聚仙莊飲品有限公司;甲醇(色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司;二甲基亞砜(DMSO) sigma公司;RPMI Medium 1640 Invitrogen corporation;甲基噻唑基四唑(MTT) sigma公司;小牛血清 杭州四季清公司;胰蛋白酶 酶活力大于3800 u/mg;營養瓊脂培養基 杭州微生物試劑有限公司;乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、無水乙醇 均為分析純；細胞株 人體肝癌細胞株HepG-2、結腸癌細胞株HT-29、胃癌BGC-823 武漢博士德生物工程有限公司；金黃色葡萄球菌(Staphylococusaureus,ATCC29213)、大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC10798)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ACCC11025) 中國普通微生物菌種保藏中心。

H2050R臺式高速冷凍離心機 湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司;Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國Agilent公司;KHB ST-360型自動多功能酶標儀 上?？迫A實驗系統有限公司;BB15型二氧化碳培養箱 美國Thermo;CKX41型倒置顯微鏡 日本OLYMPUS;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DNP-9162型電熱恒溫培養箱 寧波江南儀器廠;LDZX-40BⅠ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器 金壇市科析儀器有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;牛津杯(外徑8 mm,內徑6 mm)、培養皿等。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓皮渣花色苷提取工藝流程 藍莓皮渣解凍后于40 ℃干燥6 h,粉碎過篩(60目),準確稱取5 g粉末,用60 %酸性乙醇提取花色苷,提取溫度為40 ℃,提取時間1.5 h,5000 r/min離心10 min后抽濾,收集濾液,40 ℃減壓濃縮得到粗提液,得到藍莓皮渣花色苷提取液[8-9],測定花色苷含量為16.324 mg·g-1。

1.2.2 液相色譜分離鑒定 取2 mL花色苷提取液吸附在C18吸附樹脂小柱上,洗去柱子上吸附的糖、蛋白等物質,純化后得到花色苷溶液以備液相色譜測定。液相色譜條件:色譜柱:Agilent Zorbax SB C18柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃,進樣體積20 μL;流動相:A相為0.2%(V/V)乙腈溶液,B相為甲酸溶液;梯度:0～5 min,10% A;5～20 min,10%～30% A;25～30 min,10% A;流速1 mL/min;DAD掃描波長范圍225～600 nm,檢測波長535 nm,對分離的花色苷色譜峰進行紫外-可見光譜分析[10-11]。

含量(mg·g-1)=樣品峰面積×標準品濃度(mg·g-1)×樣品體積(μL)/(標準品峰面積×取樣量(μL))

式(1)

1.2.3 藍莓皮渣花色苷抑菌活性研究

1.2.3.1 供試菌株的活化 在超凈工作臺中,將供試菌株接入相應的試管斜面培養基上,置于37 ℃培養箱內培養18～24 h,培養完之后將培養基置于0～4 ℃冷藏備用。用接種環從斜面培養基上挑去一環置于10 mL滅菌培養基中,于37 ℃搖床中培養24 h后,菌懸液濃度約為106～107CFU/mL[12]。

1.2.3.2 藍莓皮渣花色苷抑菌活性的測定 吸取1 mL菌懸液于滅菌的培養皿中,將冷卻至40～50 ℃的固體培養基倒入平皿中,輕輕搖勻靜置冷卻。將牛津杯輕輕放置于平板上,每皿設置樣品組,對照(相應溶劑、無菌水),每組設3個平行。然后在37 ℃暗處培養24 h后觀察結果,測定抑菌圈直徑[12]。

1.2.3.3 藍莓皮渣花色苷最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用液體稀釋法測定取18支試管,分三組。配制細菌液體培養基,將液體培養基和試管分別在121 ℃滅菌20 min。冷卻后,試管中各加入1 mL液體培養基,每種菌的第一支試管加入1 mL抑菌液,按照兩倍稀釋法,將抑菌液配成不同的濃度。每組試管中各加入對應實驗菌0.1 mL,搖勻。將試管置入37 ℃恒溫培養箱中培養24 h,觀察細菌生長情況[12]。

1.2.4 藍莓皮渣花色苷抑制癌細胞增殖作用的測定

1.2.4.1 溶液的配制以及細胞的培養 根據細胞實驗的要求分別配制以下溶液:MTT 溶液(準確稱取50 mg MTT 溶解于配制好的PBS 緩沖液中);胎牛血清(將胎牛血清瓶在56 ℃水浴鍋中滅活30 min后分裝);細胞培養液(改良型1640培養基過0.22 μm濾菌膜,并加入10%已滅活的胎牛血清以及0.1% 青鏈霉素混合液)。從-80 ℃冷柜中取出結腸癌細胞、胃癌細胞和肝癌細胞,首先將細胞復蘇,再進行細胞培養和細胞傳代,所有操作在超凈工作臺中進行,并且嚴格按照無菌操作規范進行操作,防止細胞染菌[13]。

1.2.4.2 藍莓皮渣花色苷對癌細胞抑制率的測定 將處于對數期的三種癌細胞按照傳代的方法制成細胞懸液,經胰蛋白酶消化后,用培養基稀釋成1×105個/mL。在96孔板的每孔中加入100 μL 的細胞懸液,置于37 ℃的CO2培養箱中培養24 h。再取出孔板,每個細胞設置5個藥物濃度組以及一個空白組,培養24 h。培養時間到后,每孔中加入10 μL MTT,37 ℃的CO2培養箱中培養4 h。培養時間到后,移液槍移去上清液,加入150 mL DMSO溶液,振蕩10 min,用酶標儀測定吸光值。并按下式計算抑制率:

癌細胞抑制率(%)=(1-實驗組抑制率/空白組抑制率)×100

式(2)

表1 花色苷對細菌的抑菌效果(以抑菌圈直徑表示,mm)Table 1 Antibacterial activity of anthocyanin from blueberry pomace(Diameters of inhibition zone,mm)

注：數值=平均值±標準誤差,采用單因素方差分析法(ONE-WAY ANOVA 法)進行比較,行中相同字母表示差異不顯著,列中相同數量“*”表示差異不顯著,檢驗的顯著性水平為p=0. 05。

表2 藍莓皮渣花色苷抑菌的MICTable 2 The MIC of anthocyanin from blueberry pomace

注：-表示無細菌生長,溶液澄清;+表示有細菌生長,溶液稍見渾濁;++表示有細菌生長,溶液很渾濁。

2 結果與討論

2.1 藍莓皮渣花色苷的液相色譜

從圖1 的保留時間判斷峰4可能是矢車菊素-3-葡萄糖苷,峰5可能是矢車菊素-3-蕓香糖苷,峰7可能是芍藥-3-葡萄糖苷。由于缺少其他峰的標準品,因此無法對其他組分進行定性分析。綜合分析,藍莓皮渣花色苷中芍藥-3-葡萄糖苷含量相對較高,芍藥-3-葡萄糖苷占了總花色苷含量的21.75%,為3.55 mg·g-1。矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷分別占了總花色苷含量的9.05%和7.29%,為1.477和1.19 mg·g-1。有學者發現,通過高效液相和質譜分析藍莓花色苷有10～17種花色苷單體[14-16],且其主要成分大約有矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷等[16]。

圖1 藍莓皮渣花色苷高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of anthocyanin from blueberry pomace注:a是標準品在高效液相色譜上的洗脫曲線,b是樣品在高效液相色譜上的洗脫曲線;a圖中,按照出峰時間先后,三個峰分別是矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷、芍藥-3-葡萄糖苷。

2.2 藍莓皮渣花色苷的抑菌效果

藍莓皮渣花色苷對3種細菌的抑菌圈大小測定結果見圖2和表1。由圖2和表1可知,不同濃度的藍莓皮渣花色苷對3種細菌均有不同程度的抑制效果,且抑制效果隨樣品劑量增加而不同程度的增加,表明其抑菌效果不斷增強,同時藍莓皮渣花色苷對實驗菌均有不同程度的抑制作用。由表2可得,藍莓皮渣花色苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑制濃度分別為1.25、0.63、0.63 mg/mL,可知藍莓皮渣花色苷對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的效果要好于氣單胞菌。韓永斌[17]等通過紫薯花色苷抑菌實驗研究發現,紫薯花色苷對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有良好的抑菌效果,且其抑菌作用與花色苷濃度成正比,與本實驗結果相似。這些結果表明花色苷物質對許多微生物具有不同程度的抑菌活性。文獻[18]表明花色苷的抑菌作用可能是通過增強細胞膜的通透性,使細胞異常生長,以及改變蛋白質的結構、抑制微生物的呼吸代謝、影響核酸合成等途徑[19-20],從而抑制細菌生長。

圖2 藍莓皮渣花色苷抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of anthocyanins from anthocyanin from blueberry pomace注:1:無菌水;2,5,7:1 mg/mL花色苷;3,6,9:2 mg/mL 花色苷;4,8,10:4 mg/mL花色苷。

2.3 藍莓皮渣花色苷抑制癌細胞增殖作用

本實驗采用MTT法對不同濃度的藍莓皮渣花色苷作用下細胞24 h的增殖抑制率進行了測定。圖3分別表示結腸癌、胃癌、肝癌細胞加藥后分別培養24 h后的抑制率圖。從圖3中可以看出,藍莓皮渣花色苷對結腸癌、胃癌、肝癌細胞增殖都有一定的抑制作用,隨著樣品質量濃度的增加,抑制率也隨之升高。根據抑制率曲線計算藍莓皮渣花色苷抑制結腸癌、胃癌、肝癌的IC50分別7.54,13.34,21.05 μg/mL。

圖3 藍莓皮渣花色苷對癌細胞的抑制率Fig.3 The inhibition rate of anthocyanin on cancer cell

Giudice A[21]等研究發現花色苷可以誘導II相解毒酶,如UGT、GST、NAD(P)H和抗氧化酶解除致癌物的毒性,從而發揮抗細胞損傷和致癌的化學預防效應。曾林釵等人[23]研究發現矢車菊素-3-葡萄糖苷可抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的生長,其抑制機理可能是通過抑制Mucin-4蛋白表達而抑制癌細胞的生長,從而達到抗癌的目的。國內外研究報告表明,花色苷可以通過抗氧化、激活II相解毒酶、抑制蛋白表達、誘導細胞凋零等方式抑制癌細胞的生長增殖,從而達到抗癌的目的。本實驗結果表明,藍莓皮渣中的花色苷在一定程度上可以抑制癌細胞的增長繁殖,其中對結腸癌細胞的抑制效果最好,胃癌細胞次之,肝癌最差。

3 結論

藍莓皮渣花色苷含有10種組分,其中3種分別是矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷和芍藥-3-葡萄糖苷,三者分別占藍莓皮渣總花色苷含量的21.75%、9.05%和7.29%。通過牛津杯法進行抑菌性實驗,結果表明,花色苷對枯草芽孢桿菌的抑制作用最好,不僅抑菌圈直徑大,其MIC也低,為0.63 mg/mL;對金黃色葡糖球菌也有較好的抑制作用,其MIC為0.63 mg/mL;對大腸桿菌的抑菌效果也很明顯,其MIC為1.25 mg/mL。綜合考慮,藍莓皮渣花色苷對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好,其次為金黃色葡萄球菌,最后為大腸桿菌。通過MTT實驗結果表明藍莓皮渣花色苷對結腸癌、胃癌、肝癌細胞的增殖都有一定的抑制作用,藍莓皮渣花色苷對三種癌細胞的抑制效果為結腸癌細胞最好,胃癌細胞次之,肝癌最差。抑制結腸癌、胃癌、肝癌的IC50分別7.54,13.34,21.05 μg/mL。

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Study on tumor suppression and antibacterial effect of anthocyanin from blueberry pomace

CHEN Ke-fei,WANG Hong-fei*,WANG Chun-xing,XIONG Qian, SONG Jia-min,CHENG You-sheng,XU Feng

(Department of Food Science and Engineering,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Anthocyanins were extracted by ethanol from blueberry pomace. The anthocyanin compositions in blueberry pomace were isolated using high performance liquid chromatography(HPLC).Oxford cup assay was performed to determine the antibacterial effects of anthocyanins usingEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandBacillussubtilisas the representatives of the three types of bacteria. The antibacterial spectrum of blueberry pomace-derived anthocyanins was preliminarily identified,and the minimum inhibitory concentration was confirmed by sequential 2-fold dilution. Anti-proliferation activity of anthocyanins at different concentrations against colorectal cancer,gastric cancer and hepatic carcinoma cells were determined by MTT assay. Anthocyanins inhibited the three types of bacteria,with MIC values of 0.63,0.63,1.25 mg/mL,forBacillussubtilis,StaphylococcusaureusandEscherichiacoli,respectively. Blueberry pomace-derived anthocyanins also inhibited all three types of cancer cells,with IC50values of 7.54,13.34,21.05 μg/mL for colorectal cancer,gastric cancer,and liver cancer cells,respectively. Blueberry pomace derived anthocyanins have certain antibacterial and anticancer activity,and the study has important theoretical and practical significance to reveal mechanism of developing new anticancer drugs.

blueberry pomace;anthocyanin;tumors;antibacterial effect

2016-11-17

陳柯斐(1997-),女,本科生,研究方向:農產品貯藏加工,E-mail:2021521738@qq.com。

*通訊作者:王鴻飛(1964-),男,碩士,教授,研究方向:農產品加工與貯藏,E-mail:wanghongfei@nbu.edu.cn。

浙江省自然科學基金(LY16C200003)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)11-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.059