一種含姜黃食品對去卵巢模型鼠骨組織的影響

陸 寬,張 潔,劉文煒,霍 昕,劉建華,高玉瓊,馮發進

(1.貴州省生物技術研究開發基地,貴州貴陽 550002; 2.貴州省科暉制藥廠,貴州貴陽 550011; 3.貴州醫科大學,貴州貴陽 550025; 4. 貴陽中醫學院第一附屬醫院,貴州貴陽 550002; 5.貴州省中科院天然產物化學重點實驗室,貴州貴陽 550002)

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一種含姜黃食品對去卵巢模型鼠骨組織的影響

陸 寬1,2,張 潔3,劉文煒4,*,霍 昕1,劉建華5,高玉瓊1,馮發進1

(1.貴州省生物技術研究開發基地,貴州貴陽 550002; 2.貴州省科暉制藥廠,貴州貴陽 550011; 3.貴州醫科大學,貴州貴陽 550025; 4. 貴陽中醫學院第一附屬醫院,貴州貴陽 550002; 5.貴州省中科院天然產物化學重點實驗室,貴州貴陽 550002)

目的:探討一種含姜黃食品對去卵巢模型鼠骨組織變化的影響。方法:采用雙側去卵巢法制備去卵巢誘發骨質疏松大鼠模型,將動物分為假手術組、模型對照組、含姜黃受試物組和不含姜黃受試物組,連續喂養90 d,測定各組大鼠體重變化、血清中骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)及核因子Κ-β受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor Κ-βLigand,RANKL)水平、大鼠股骨長度以及骨組織形態學檢測。結果:喂養90 d后,姜黃組大鼠體重增長趨勢與假手術組較為接近(p>0.05)。姜黃組大鼠血清OPG水平、股骨長度、骨小梁厚度以及成骨細胞數顯著高于模型對照組(p<0.01),RANKL水平、骨小梁間隙以及破骨細胞數顯著低于模型對照組(p<0.01)。姜黃組與不含姜黃組比較,大鼠血清中OPG、骨小梁厚度高于不含姜黃組(p<0.05),RANKL、骨小梁間隙低于不含姜黃組(p<0.05);姜黃組大鼠股骨長度及成骨細胞數顯著高于不含姜黃組(p<0.01),破骨細胞數顯著少于不含姜黃組(p<0.01)。結論:實驗結果表明,此含姜黃食品對去卵巢模型鼠骨組織退變有一定的抑制作用。

姜黃,去卵巢模型鼠,骨質疏松,骨組織

骨質疏松癥(Osteopomsis,OP)的發生與激素調控、免疫功能、鈣吸收、生活習慣等密切相關,在年齡60歲以上人群和絕經后婦女中尤為常見[1]。絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal,PMOP)是最常見的原發性骨質疏松癥,是由于絕經后女性卵巢功能衰退、雌激素水平下降、骨吸收大于骨形成的高轉換代謝引發的一種全身性骨骼疾病[2-3]。目前,醫學領域習慣采用激素替代療法來減少更年期骨折的風險[4-6],但是激素替代療法單用雌激素又往往會增加絕經后女性患子宮內膜癌、乳腺癌等癌癥的風險[7-8]。因此,許多研究人員把注意力逐漸轉移到副作用小,且具有明確療效的保健食品領域。

姜黃,又稱寶鼎香,姜科姜黃屬多年生草本植物,是國家公布可用于保健食品的植物原料之一,在亞洲主要用來制作為香料、調味料或著色劑,具有使用普遍、安全性高的特點。姜黃的主要功能性成分為姜黃素,其抗菌[9-10]、抗氧化[11]、減肥降脂[12]、抗腫瘤[13-14]、預防老年癡呆[15-16]及保肝[17]等作用被人們所熟知。隨著對姜黃研究的不斷深入,國內外研究人員逐漸將注意力轉移到姜黃及其復方制劑或食品在預防絕經后女性骨質疏松模型方面的研究[18-20]。本文在前期研究基礎上,根據中醫藥理論擬定此含姜黃食品配方,以大鼠去卵巢誘導的絕經后骨質疏松癥動物模型為研究對象,通過研究此食品配方對去卵巢大鼠骨保護素(Osteoprotegerin,OPG)、核因子Κ-β受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor Κ-βLigand,RANKL)水平、股骨長度及股骨形態計量學參數等指標的影響,為其應用于開發預防骨質疏松食品提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃、骨碎補、黃芪、葛根、山藥、茯苓、薏苡仁 均符合中國藥典(2010版)規定;大鼠OPG ELISA試劑盒、大鼠RANKL ELISA試劑盒 南京建成科技有限公司;水合氯醛(分析純) 天津市科密歐化學試劑有限公司,批號:20130110;青霉素(80萬單位) 哈藥集團制藥總廠,批號:A1310001;甲醛、酒精、二甲苯 國產分析純;普通大鼠飼料 重慶騰鑫生物技術有限公司(因大豆中的大豆異黃酮具有雌激素樣作用,避免對實驗造成影響已用適當物質替換飼料中來源于大豆的成分);實驗動物 SD雌性大鼠40只,SPF(Specific pathogen Free)級,體重200～250 g,由重慶騰鑫生物技術有限公司提供,動物合格證號:SCXK(渝)2012-0005。動物由專人飼養管理,分籠喂養,單只單籠,每2 d更換一次墊料,室溫18～26 ℃,濕度40%～70%。

BL-150電子天平 德國Sartorius;0412-1臺式離心機 上海醫療器械有限公司;GF-M3000酶標儀 山東高密彩虹分析儀器有限公司;RM2235型切片機 德國Leica;YT-6C型生物組織攤烤片機 湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司;BX51型光學顯微鏡 日本OLYMPUS。

1.2 實驗方法

1.2.1 受試樣品制備 取骨碎補3份、黃芪6份,用6倍重量水提3次,合并水提液,濃縮,得骨碎補、黃芪浸膏,備用。取姜黃1份、葛根3份、山藥6份、茯苓3份、薏苡仁6份粉碎成粗粉,備用。將骨碎補、黃芪浸膏與姜黃、葛根、山藥、茯苓、薏苡仁粗粉均勻混合,再與正常飼料混勻制備得到含姜黃受試物樣品飼料。另外,按以上相同步驟制備不添加姜黃受試物樣品飼料。

1.2.2 實驗動物分組 40只SPF級大鼠(雌性,體重200～250 g),適應飼養1周后,隨機分為假手術組、模型對照組、含姜黃受試物組(以下簡稱姜黃組)、不含姜黃受試物組(以下簡稱不含姜黃組),每組10只。姜黃組喂食含姜黃受試物樣品飼料,不含姜黃組喂食不含姜黃受試物樣品飼料,假手術組及模型對照組喂食普通飼料,正常飲水飲食,連續喂食90 d,記錄各組每只動物進食量。

1.2.3 大鼠骨質疏松模型建立 以10%水合氯醛,按0.35 mL/100 g體重腹腔注射麻醉,經背部肋脊角切口摘除大鼠雙側卵巢[21]。術后經后肢肌肉注射青霉素預防感染,連續5 d。術后5 d進行陰道涂片,連續7 d,剔除造模失敗不合格大鼠。假手術組動物進行同樣手術步驟,但不摘除大鼠雙側卵巢。

1.2.4 分析測定

1.2.4.1 體重變化 手術前稱量各組大鼠體質量,手術后每30 d稱量各組大鼠體質量,取手術前、30、60、90 d后各組大鼠體重數據進行分析。

1.2.4.2 OPG、RANKL酶聯反應檢測 大鼠喂食90 d后眼球摘除法采血,室溫血液自然凝固10～20 min,離心20 min左右(2000～3000 r/min),仔細收集上層血清。分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。分別在OPG、RANKL酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL,然后將樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復5次,拍干。除空白孔外每孔加入酶標試劑50 μL。用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復5次,拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL,輕輕振蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL,終止反應。以空白調零,450 nm波長依序測量各孔的吸光度,檢測大鼠血清中OPG、RANKL水平。

1.2.4.3 股骨長度及骨形態計量學測定 喂養90 d后處死各組大鼠,取大鼠左右股骨,去除周圍軟組織,測量左右股骨長度。將股骨置于10%甲醛溶液中固定48 h后,置于中性混合脫鈣液中脫鈣。將脫鈣完成后的股骨流水沖洗干凈,取其下三分之一,沿矢狀面縱行切開。將股骨放入自動脫水機中脫水、透明、浸蠟12 h。在包埋框中注入熔化的石蠟,將股骨縱切面朝下置于包埋框內,使蠟塊迅速冷卻。將凝固的石蠟塊四周修理整齊,并編碼標記。用切片機沿股骨矢狀面切成5 μm薄片,置于溫水中展開用普通載玻片撈出待做HE染色切片,放入溫箱內烘干。將石蠟包埋切片脫蠟,用蘇木素、伊紅染色,脫水后烤箱烘干,樹膠封片。檢查大鼠股骨的骨小梁厚度、骨小梁間隙、成骨細胞數以及破骨細胞數等指標。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 對骨質疏松大鼠體重變化的影響

圖1 實驗期間各組大鼠體重的變化Fig.1 Body weight changes of rats during the experiment(±s,n=10)注:與模型對照組比較,a為p<0.05,A為p<0.01; 與假手術組比較,b為p<0.05,B為p<0.01;與姜黃組比較, c為p<0.05,C為p<0.01;圖2～圖5同。

由圖1可知,去卵巢前各組大鼠體重均值基本一致,手術后各組大鼠體重迅速增長。喂養90 d后,與假手術組比較,模型對照組、姜黃組、不含姜黃組大鼠體重均有所增加,因為除假手術組外其余處理組去卵巢后,大鼠雌激素分泌減少,導致體重增加。資料顯示,雌激素可提高血液中載脂蛋白A1的含量,降低血清總膽固醇(TC)濃度,使β-脂蛋白減少、膽固醇與磷脂比例下降等作用[22],因此,可通過補充雌激素或雌激素樣作用的物質緩解因雌激素缺乏導致脂代謝紊亂而引起的體重增長。模型對照組大鼠體重增長最為明顯(p<0.01),分別為假手術組、姜黃組及不含姜黃組的1.12倍、1.10倍及1.09倍,并且姜黃組與假手術組體重增長趨勢較為接近(p>0.05),這是因為食品配方中含有葛根,具有一定的雌激素樣活性作用[23-25],可顯著降低去卵巢大鼠血清TC和肝臟中TG水平,且姜黃中的姜黃素能夠降低大鼠血清中總膽固醇水平[26],從而抑制雌鼠體重過度增加。

2.2 對骨質疏松大鼠血清中OPG、RANKL水平測定結果

OPG是1997年由Simonet等發現[27]的一種分泌型糖蛋白,是RANKL的誘導受體,通過與RANKL的結合減少破骨細胞的產生。RANK 是由Anderson 等[28]發現的,與RANKL結合進而啟動一系列信號轉導途徑[29]。RANK/RANKL信號通路參與破骨細胞的生成調節,成骨細胞表達RANKL,與破骨細胞前體細胞表面的RANK結合,促進破骨細胞的分化及活性,同時成骨細胞又可分泌OPG,與RANKL競爭性結合,從而阻止RANKL與破骨細胞上的RANK結合,抑制破骨細胞形成、分化、存活、活化并誘導破骨細胞凋亡,使骨量增加。因此,OPG、RANKL水平與破骨細胞的生成密切相關,并最終影響骨密度和骨強度。

由圖2可知,姜黃組、不含姜黃組與假手術組對比,大鼠OPG水平分別降低了13.5 ng/L(p<0.01)、20.33 ng/L(p<0.01),RANKL水平分別升高了0.005 nmol/L(p<0.01)、0.016 nmol/L(p<0.01)。這是因為雌激素缺乏,導致大鼠內分泌失調,損害了細胞內抗氧化系統,從而導致細胞內發生氧化應激作用,促進RANKL分泌[30-31]。

圖2 姜黃對大鼠血清中OPG及RANKL水平的影響Fig.2 Effect of turmeric on OPG and RANKL of rats(±s,n=10)

姜黃組、不含姜黃組與模型對照組對比,大鼠血清OPG水平分別升高了16.83 ng/L(p<0.01)、10.00 ng/L(p<0.01),RANKL水平分別降低了0.019 nmol/L(p<0.01)、0.0086 nmol/L(p<0.01)。姜黃組與不含姜黃組對比,大鼠血清OPG水平分別升高了6.83 ng/L(p<0.01),RANKL水平分別降低了0.011 nmol/L(p<0.01)。說明姜黃組與不含姜黃組食品配方對提高OPG表達及抑制RANKL水平表達有一定的積極作用,這是因為兩組配方中的葛根中含有類雌激素物質,一定程度上發揮了雌激素樣的活性作用[23-25],且配方中骨碎補中含有的黃酮類物質對OPG的增加及RANKL的減少均有一定的作用[32]。通過姜黃組與不含姜黃組比較可知,含姜黃的食品配方作用更好,此結果與李義等[33]研究得出的結論相一致。這是因為,炎性細胞因子白細胞介素(interleukin,IL)-1可以促進RANKL的表達[34],而姜黃中的姜黃素能夠通過下調IL-1的方式抑制細胞內氧化應激作用的發生[35],從而促進OPG的表達,抑制RANKL的分泌。

2.3 實驗大鼠股骨形態計量學參數結果

骨組織形態計量學是在骨代謝領域中的重要研究工具,是評價骨轉換與骨結構的有效研究手段。骨小梁厚度、骨小梁間隙等靜力學指標反映單位面積內骨小梁連接狀況和骨小梁本身的結構特征,骨結構越優化,骨的抗骨折能力就越強。骨小梁厚度、骨小梁間距是反映骨結構的參數,成骨細胞數及破骨細胞數則反映骨形成和骨吸收的骨重建參數,并能解釋骨結構參數的變化。幾個指標之間密切相關,互相聯系。

2.3.1 對大鼠股骨長度的影響 由圖3可知,姜黃組、不含姜黃組及模型對照組較假手術組大鼠股骨平均長度分別低0.01、0.005、0.015 cm,其中,姜黃組與假手術組無明顯差異(p>0.05),而另外兩組與假手術組均存在顯著性差異(p<0.01)。這是因為大鼠雙側摘除卵巢后,由于雌激素缺乏而導致破骨細胞功能亢進,骨更新速度加快[36-37]。姜黃組、不含姜黃組與模型對照組比較,大鼠股骨長度分別較模型對照組長0.13、0.10 cm,且姜黃組較不含姜黃組大鼠股骨平均長度長0.04 cm。說明姜黃組與不含姜黃組食品配方對大鼠股骨長度縱向生長有一定的促進作用,且姜黃組對模型鼠股骨縱向生長促進作用更為明顯,是由于姜黃素能夠降低血骨鈣素濃度,對模型鼠體內破骨細胞介導的骨吸收有抑制所用[35],結果與Sophocleous等[38]得出結論一致。

圖3 姜黃對大鼠股骨長度的影響Fig.3 Effect of turmeric on the femur

2.3.2 對大鼠股骨結構參數的影響 由圖4可知,假手術組骨小梁厚度為(27.92±7.5) μm,骨小梁間隙為(11.30±4.71) μm。姜黃組、不含姜黃組及模型對照組與假手術組比較,骨小梁厚度分別降低了11.6%、27.3%、73.35%,其中姜黃組與假手術組骨小梁厚度無明顯差異(p>0.05);骨小梁間隙分別增加了61.2%、101%、162%。這是因為骨的重塑是一種動態平衡過程,雌激素缺乏會導致骨吸收增加而骨形成減少,破壞了原有的動態平衡系統,從而導致骨小梁厚度變薄[39]以及骨小梁間距增加[40]。

圖4 姜黃對大鼠股骨骨小梁厚度及間隙的影響Fig.4 Effect of turmeric on trabecular thickness and space of rats(±s,n=10)

姜黃組、不含姜黃組骨小梁厚度均高于模型對照組(p<0.01),分別為模型對照組的3.3倍和2.7倍,骨小梁間隙均低于模型對照組(p<0.01),分別為模型對照組的61.5%和76.7%;姜黃組與不含姜黃組比較,骨小梁厚度增加了4.38 μm(p<0.01)、骨小梁間隙減少了4.5 μm(p<0.05)。這是因為兩組配方中均有雌激素樣作用活性成分,能夠對骨重塑平衡起到一定的促進作用。并且,姜黃素能夠調控多種重要的靶分子,如:轉錄因子、激活蛋白-1、白細胞介素-1等[41]參與骨重塑的調控[42],進而達到穩定其平衡的作用。

2.3.3 對大鼠股骨靜態參數的影響 如圖5所示,姜黃組、不含姜黃組、模型對照組與假手術組比較,成骨細胞數分別降低了9.6%、26.5%、54.2%,破骨細胞數分別增高了40%、133%、253%,且均呈顯著性差異(p<0.01)。這是因為雌激素缺乏會誘導破骨細胞的增殖、分化[43],從而導致成骨細胞的降低及破骨細胞的增加。

圖5 姜黃對大鼠股骨成骨細胞數及破骨細胞數的影響Fig.5 Effect of turmeric on osteoblast and osteoclast in rats(±s,n=10)

姜黃組、不含姜黃組與模型對照組比較,成骨細胞數分別高97%、60.5%,破骨細胞數分別低60%、34%,均呈現顯著性差異(p<0.01)。姜黃組的成骨細胞數比不含姜黃組的高23%(p<0.01),破骨細胞數低40%(p<0.01)。這是因為兩組配方中的成分發揮了雌激素樣活性作用,抑制了破骨細胞的分化、增值。并且,多個研究組研究發現,姜黃素能夠通過不同路徑以不同方式對破骨細胞進行作用,促進其成熟、凋亡[31,44-46]。

3 結論

本實驗研究結果表明,該含姜黃食品配方對大鼠體重不正常增長、骨小梁厚度的降低、骨小梁間隙的變大、成骨細胞水平的降低以及破骨細胞水平的升高均有一定的抑制作用,對大鼠股骨長度的增長有一定的促進作用。說明此含姜黃的食品配方能夠維持大鼠骨量、延緩骨結構的破壞,通過減少、抑制具有骨吸收作用破骨細胞的數量、活性和壽命來減少骨質流失率。并且,各組成骨細胞及破骨細胞分化情況與血清中OPG及RNAKL表達水平結果相一致,說明各項指標之間具有良好的相互關聯性。本研究為此含姜黃食品配方開發成為預防絕經后女性骨質疏松保健食品提供了一定的理論及實驗基礎。

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Effects of the food contained turmeric on bone tissue in ovariectomized rats

LU Kuan1,2,ZHANG Jie3,LIU Wen-wei4,*,HUO Xin1,LIU Jian-hua5,GAO Yu-qiong1,FENG Fa-jin1

(1.Guizhou Institute of Biotechnology Research and Development,Guiyang 550002,China; 2.Kehui Pharmaceutical Factory in Guizhou Province,Guiyang 550011,China; 3.Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China; 4.Guizhou Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550002,China; 5.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,China)

Objective:To explore the effects of the food contained turmeric on bone tissue in ovariectomized rats. Methods:The osteoporosis model was established by removing the ovaries of the rats. The animals were divided into sham group,model group,turmeric group,and excluding turmeric group,continuous feeding 90 d. Then,the weight,femur length,and bone parameters of each group were measured. Blood was gained from the eyeballs of rats. Osteoprotegerin(OPG)and receptor activator for nuclear factor Κ-βligand(RANKL)level were measured by ELISA method. Results:The rats weight of turmeric group increased relatively close to the control group(p>0.05). The turmeric group had significant increase(p<0.01)in the level of OPG,femur length,trabecular thickness,and the number of osteoblast,as well as significant decrease(p<0.01)in the level of RANKL,trabecular space,and the number of osteoclast compared to the model group. The turmeric group had significant increase in the level of OPG and trabecular thickness(bothp<0.05),femur length and the number of osteoblast(bothp<0.01),as well as significant decrease in the level of RANKL and trabecular space(bothp<0.05),the number of osteoclast(p<0.01)compared to the excluding turmeric group. Conclusion:The results indicated that the food contained turmeric had inhibitory effect on bone tissue degeneration in ovariectomized rats.

turmeric;ovariectomized rats;osteoporosis;bone tissue

2016-12-02

陸寬(1987-)，男，碩士，助理研究員，主要從事保健食品研發及中藥研究,E-mail:wukong4608@163.com。

*通訊作者:劉文煒(1982-)，女，碩士，主管藥師，主要從事中藥制劑開發研究，E-mail:khliuwenwei@163.com。

貴州省社會發展攻關計劃項目[黔科合SY字(2014)3013]；貴州省開發類科研院所技術開發研究專項資金項目[黔科合成字(2013)5028];貴州省科技人才建設項目[黔科合人才團隊(2014)4011]。

TS201.4

A

1002-0306(2017)11-0334-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.056