超微粉碎與超聲波組合輔助胃蛋白酶水解乳清蛋白效果研究

清 源

(西昌學院農業科學分院,四川西昌 615013)

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超微粉碎與超聲波組合輔助胃蛋白酶水解乳清蛋白效果研究

清 源

(西昌學院農業科學分院,四川西昌 615013)

本文將超微粉碎技術和超聲波技術組合應用于胃蛋白酶水解乳清蛋白效果的研究。目的在于探討兩種技術的聯合作用下,胃蛋白酶水解乳清蛋白的效果和規律。在單因素實驗的基礎上,選取了超微粉碎目數、超聲波處理功率、超聲波處理時間為影響因子,以水解后可溶性蛋白含量為響應面值,應用響應面設計方法建立數學模型,進行響應面分析。結果表明,獲得最佳水解效果的實驗因素組合為:超微粉碎目數2000目,超聲波處理功率250 W,超聲波處理時間50 min。各實驗因素對可溶性蛋白含量影響由大到小依次為:超聲波處理功率>超聲波處理時間>超微粉碎目數。經過最佳實驗因素組合處理獲得的可溶性蛋白含量為6.03 mg/mL,為未采用組合處理樣品可溶性蛋白含量的1.39倍。

超微粉碎,超聲波,胃蛋白酶,乳清蛋白

乳清蛋白作為一種優質蛋白,因其具有易消化吸收、氨基酸組分合理等特點而被稱為“蛋白之王”,是世界公認的最適宜人體攝取吸收的補充蛋白質之一。目前,乳清蛋白主要是從牛奶中提取獲得。但相對人乳而言,牛乳中含量較高的β-乳球蛋白會導致嬰幼兒在食用乳清蛋白時發生過敏反應。在嬰幼兒奶粉制造的過程中,有效的降低乳清蛋白中β-乳球蛋白的過敏性,具有極其重要意義[1]。對乳清蛋白進行水解是當前降低乳清蛋白中β-乳球蛋白過敏性的主要方法之一[2]。目前,酶解乳清蛋白是較為常用的水解乳清蛋白的方法之一,常用的酶主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶等。其原理在于:通過采用這些蛋白酶作用于乳清蛋白之后,可以使β-乳球蛋白過敏性降低[3]。不同類型的蛋白酶作用于乳清蛋白后,對乳清蛋白過敏性降低的效果也不相同。

超微粉碎技術是利用機械粉碎的方法克服物體內部凝聚力并使之破碎的粉碎技術,可以使物料的粒度達到10 μm以下,甚至達到1 μm的超微米水平。超聲波技術是利用頻率在20～10 MHz的電磁波產生的空化效應,來促進物質溶解的技術[4]。超聲波技術被廣泛的應用于輔助蛋白質的水解、萃取和改性[5]。研究證明,超微粉碎技術和超聲波處理技術都被證明能夠有效的輔助不同的蛋白酶進行乳清蛋白的水解:任守國[6]研究發現,胃蛋白酶對超微豆粕粉體中抗原蛋白的消化速度高于常規粉碎豆粕粉體;EI Mecherfi[7]研究發現,超聲波技術可以有效的輔助胃蛋白酶水解β-乳球蛋白;Izquierdo[8]研究發現,超聲波技術可以破壞β-乳球蛋白的過敏表位,降低其過敏性。本文立足于超微粉碎技術和超聲波處理技術應用于乳清蛋白水解效果的研究,通過響應面實驗設計方法來探討兩種技術的聯合作用下,胃蛋白酶水解乳清蛋白的效果和規律。

表1 不同試管中試劑添加量Table 1 Reagent adding quantity in different test tubes

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白 美國HILMAR公司;胃蛋白酶,酶活為3000 U/mg 北京索萊寶科技有限公司;牛血清白蛋白 中國科學院生物物理所生化廠;福林酚 唐河天弘化學品有限公司;考馬斯藍量G-250試劑 北京索萊寶科技有限公司;碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅 上海云嶺化工廠。

UV-2500紫外可見分光光度計 日本島津株式會社;電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器公司;臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠;SHB-3型循環水多用真空泵 鄭州豫華儀器制造有限公司;磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機廠;電子天平 上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃蛋白酶水解乳清蛋白工藝過程 參考卞蓉霞[9]的胃蛋白酶的最適反應條件,進行樣品制備:準確稱量乳清蛋白1.10 g,融于18.90 mL超純水中,充分攪拌使其溶解后。然后將其置于恒溫磁力攪拌水浴鍋上,加入55 mg胃蛋白酶啟動酶解反應,恒溫水浴將溶液加熱至胃蛋白酶最適溫度40 ℃,并以1 mol/L鹽酸進行調節,使溶液pH穩定在胃蛋白酶的最適pH,即pH為2.0。反應4 h后立即將溶液置于100 ℃恒溫水浴中滅活10 min。之后先利用超微粉碎技術對實驗樣品進行處理,再利用超聲波處理技術對實驗樣品進行處理。最后進行測定樣品的可溶性蛋白含量。

1.2.2 胃蛋白酶水解乳清蛋白后可溶性蛋白含量的測定 本實驗過程中胃蛋白酶水解乳清蛋白后可溶性蛋白含量的測定采用的是福林酚法[10]。實驗測定過程如下:

試劑甲的制備:A溶液:10 g碳酸鈉,2 g氫氧化鈉和0.25 g酒石酸鉀鈉溶解于500 mL蒸餾水中,現配現用;B溶液:0.5 g無水硫酸銅溶解于100 mL蒸餾水中。每次使用前將A與B液50∶1混合,即為試劑甲。

試劑乙的制備:將福林酚試劑稀釋一倍,即為試劑乙。

取水解后的乳清蛋白溶液1 mL,并稀釋至50倍,裝于10 mL EP管中。加入試劑甲5 mL,搖勻后室溫放置10 min,再加入0.5 mL試劑乙,搖勻,繼續放置30 min,在650 nm處測定其吸光度。以牛血清白蛋白為標準做標準曲線,計算水解液中的可溶性蛋白的濃度。

標準曲線制作過程:精確稱取結晶牛血清蛋白10 mg,加水溶解并定容至100 mL,即為100 μg/mL的標準蛋白質溶液。取6支試管,按照表1添加相應的試劑,蓋上塞子搖勻。放置5 min,在650 nm波長下比色測定,比色測定須在1 h內完成。以牛血清蛋白含量為橫坐標,以吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。根據標準曲線得:回歸方程為y=0.00112x;R2=0.9992。

1.2.3 單因素實驗設計 以可溶性蛋白含量為評價指標,固定超微粉碎目數3000目、超聲波處理功率150 W,超聲波處理時間30 min,考察不同的超微粉碎目數(1000、2000、3000、4000、5000目)、超聲波處理功率(50、2000、100、150、200 W)、超聲波處理時間(10、20、30、40、50 min)對可溶性蛋白含量的影響。

1.2.4 響應面實驗設計 綜合單因素實驗的結果,應用響應面法進行方案設計[11],以超微粉碎目數(X1)、超聲波處理功率(X2)、超聲波處理時間(X3)為自變量,可溶性蛋白含量(Y)為響應面值,設計3因素3水平實驗對胃蛋白酶水解乳清蛋白的工藝參數進行優化。響應面實驗設計因素水平編碼表見表2。

表2 響應面實驗設計因素水平Table 2 Factors and levels in response surface composite design

1.2.5 實驗數據分析 采用design-expert軟件進行實驗設計及相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 對照樣品可溶性蛋白含量測定

取未采用超微粉碎和超聲波組合處理的樣品作為對照樣品,測定其可溶性蛋白含量,重復3次,平均值為4.33 mg/mL。

2.2 單因素實驗分析

2.2.1 超微粉碎目數對可溶性蛋白含量的影響 由圖1可知,隨著超微粉碎目數的逐漸增加,可溶性蛋白含量首先呈現出逐漸上升的趨勢,當超微粉碎目數為3000目時,可溶性蛋白含量達到最大。之后,隨著超微粉碎目數的增加,可溶性蛋白含量呈現出下降趨勢。原因可能是:隨著超微粉碎目數的增加,物理機械剪應力直接會使乳清蛋白的部分肽鍵斷裂,形成具有可溶性的小片段蛋白質,但在超微粉碎目達到一定程度之后,超微粉碎技術帶來的物理機械剪應力對乳清蛋白產生的影響不再增加,反而會因改變了具有可溶性的小片段蛋白質的二級結構而使其可溶性降低,從而導致樣品可溶性蛋白含量減少[12]。綜合實驗結果,超微粉碎目數選擇3000目為宜。

圖1 超微粉碎目數對可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of superfine grinding orders on soluble protein content

2.2.2 超聲波處理功率對可溶性蛋白含量的影響 由圖2可知,隨著超聲波處理功率的逐漸增加,可溶性蛋白含量首先呈現出逐漸上升的趨勢,當超聲波處理功率為200 W時,可溶性蛋白含量達到最大。之后隨著超聲波處理功率的增加,可溶性蛋白含量呈現出下降趨勢。原因可能是:超聲波的高頻機械振動作用可能會使乳清蛋白的空間構象發生改變,從而導致其親水性發生變化[13]。綜合實驗結果,超聲波處理功率選擇200 W為宜。

圖2 超聲波處理功率對可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on soluble protein content

2.2.3 超聲波處理時間對可溶性蛋白含量的影響 由圖3可知,隨著超聲波處理時間的逐漸增加,可溶性蛋白含量呈現逐漸上升的趨勢,并在超聲波處理時間超過40 min后逐漸趨于穩定。當超聲波處理時間為40 min時,可溶性蛋白含量達到最大。原因可能是:超聲波的高頻機械振動作用隨著時間的推移,在應用初期可能會使乳清蛋白的空間構象迅速發生改變,從而增強其親水性,但在達到一定時間之后,乳清蛋白的空間構象并不會隨著時間的變化而產生重大改變[14]。綜合實驗結果,因此超聲波處理時間選擇40 min為宜。

圖3 超聲波處理時間對可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on soluble protein content

2.3 胃蛋白酶水解乳清蛋白的工藝參數優化實驗

2.3.1 優化實驗設計 實驗設計方案及結果見表3。

表3 實驗方案及結果Table 3 Experimental plan and results

2.3.2 回歸模型的建立與分析 以超微粉碎目數(X1)、超聲波處理功率(X2)、超聲波處理時間(X3)為實驗設計因素,應用響應面實驗設計方法,研究實驗設計因素對胃蛋白酶水解乳清蛋白后可溶性蛋白含量(Y)的影響。表3中含有實驗結果,表4為回歸方程的偏回歸系數檢驗表,表5為方差分析表。回歸方程為:

Y=5.52-0.035X1+0.19X2+0.13X3+0.042X12-0.073X22+0.022X32-0.048X1X2+0.028X1X3+0.18X2X3

由表4中回歸方程的偏回歸系數檢驗分析結果可知:

表4 回歸方程中偏回歸系數顯著性檢驗Table 4 Significance test of partial regression coefficient in the regression equation

根據一次項的F值大小,可以判斷出各實驗因素對可溶性蛋白含量影響由大到小依次為:超聲波處理功率>超聲波處理時間>超微粉碎目數。

從一次項看,超聲波處理功率(X2)、超聲波處理時間(X3)的一次項和可溶性蛋白含量呈正相關,超微粉碎目數(X1)的一次項和可溶性蛋白含量呈負相關,其中超聲波處理功率(X2)、超聲波處理時間(X3)的一次項影響顯著。

從二次項看,超微粉碎目數(X1)、超聲波處理時間(X3)的二次項和可溶性蛋白含量呈正相關,超聲波處理功率(X2)的二次項和可溶性蛋白含量呈負相關,其中超聲波處理功率(X2)的二次項影響顯著。

從交互項看,超微粉碎目數(X1)與超聲波處理時間(X3)的交互項、超聲波處理功率(X2)與超聲波處理時間(X3)的交互項和可溶性蛋白含量呈正相關,超微粉碎目數(X1)與超聲波處理功率(X2)的交互項和可溶性蛋白含量呈負相關,其中超聲波處理功率(X2)與超聲波處理時間(X3)的交互項影響顯著。

由表5方差分析結果可知,在失擬項的F值檢驗當中,F失擬=4.34

表5 方差分析結果Table 5 Variance analysis results

圖4～圖6為三個實驗因素交互作用的響應面3D及等高線分布圖。從響應面的等高線和極值點可以看出,在實驗因素交互作用中存在最大值。對比圖4～圖6中的響應面曲張程度可知,圖6的響應面曲張程度最為突出,且圖中底部的等高線更加接近于橢圓形,這就意味著超聲波處理功率(X2)與超聲波處理時間(X3)的交互項影響最為顯著。

圖4 超微粉碎目數與超聲波處理功率的響應面和等高線分析圖Fig.4 The analysis diagram of the response surface and contour line between superfine grinding orders and ultrasonic power

圖5 超微粉碎目數與超聲波處理時間的響應面和等高線分析圖Fig.5 The analysis diagram of the response surface and contour line between superfine grinding orders and ultrasonic time

圖6 超聲波處理功率與超聲波處理時間的響應面和等高線分析圖Fig.6 The analysis diagram of the response surface and contour line between ultrasonic power and ultrasonic time

2.3.3 回歸模型最優實驗組合選擇 采用design-expert軟件包的optimization choices工具箱對回歸方程進行分析處理,可以得到超微粉碎與超聲波組合處理對胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳的實驗因素組合為:超微粉碎目數1999.99目,超聲波處理功率249.54 W,超聲波處理時間49.83 min。考慮到實際操作的可行性,最佳的實驗因素組合取值應為:超微粉碎目數2000目,超聲波處理功率250 W,超聲波處理時間50 min。此時,胃蛋白酶水解乳清蛋白后的可溶性蛋白含量的理論最大值為6.06 mg/mL。

2.3.4 回歸模型最優實驗組合驗證 用超微粉碎與超聲波組合處理對胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳的實驗因素組合:超微粉碎目數2000目,超聲波處理功率250 W,超聲波處理時間50 min進行三次重復實驗,分別測定所得樣品的可溶性蛋白含量,得到三次實驗樣品的可溶性蛋白含量平均值為6.03 mg/mL。理論的可溶性蛋白含量為6.06 mg/mL,二者的相對誤差為0.49%,在允許的范圍內,說明模型擬合度較高,預測準確。

2.3.5 超微粉碎與超聲波組合處理前后可溶性蛋白含量對比分析 由驗證實驗的結果可知,采用最優的實驗因素組合,可獲得可溶性蛋白含量為6.03 mg/mL,為對照樣品可溶性蛋白含量的1.39倍。說明采用超微粉碎與超聲波組合處理可以有效促進胃蛋白酶水解乳清蛋白。原因可能是:超微粉碎與超聲波組合處理既會影響到乳清蛋白的空間構象使其親水性增加,又可能會因超微粉碎技術的物理機械剪應力而使乳清蛋白的部分肽鍵斷裂,形成具有可溶性的小片段蛋白質[15]。

3 結論

本實驗通過響應面優化實驗設計,得出各實驗因素對可溶性蛋白含量影響由大到小依次為:超聲波處理功率>超聲波處理時間>超微粉碎目數。最佳水解效果的實驗因素組合為:超微粉碎目數2000 目,超聲波處理功率250 W,超聲波處理時間50 min。在此條件下,胃蛋白酶水解乳清蛋白后的實際可溶性蛋白含量為6.03 mg/mL,為對照樣品的可溶性蛋白含量的1.39倍,說明采用超微粉碎與超聲波組合處理可以有效促進胃蛋白酶水解乳清蛋白。

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Resarch of the superfine grinding and ultrasonic assisted hydrolysis on the whey protein by pepsin

QING Yuan

(School of Agricultural Science of XiChang College,Xichang,615013,China)

This paper applied the combination of superfine grinding technology and ultrasonic technology to the research of the effect of the protein hydrolysis of whey pepsin.The impact factors including superfine grinding orders,ultrasonic power,ultrasonic time were investigated by response surface design based on the single factor experiment,with the content of soluble protein as the responses,also the mathematical models were established. The results showed that the best experiment combination factors of hydrolysis effect were superfine grinding orders 2000 of order,ultrasonic power of 250 W,ultrasonic time of 50 min. The significance of every experiment factors on the content of soluble protein was decreased according to ultrasonic power>ultrasonic time>superfine grinding orders. Under the optimal experiment combination factors,the content of soluble protein was 6.03 mg/mL,which was 1.39 times of the content of soluble protein that was not dealt with experiment combination factors.

superfine grinding;ultrasonic;pepsin;whey protein

2016-10-24

清源(1983-)，女，博士研究生，講師，研究方向：食品科學，E-mail:64899867@qq.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)11-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.036