一株乳酸乳球菌的分離鑒定及其發酵豆汁工藝優化

張莉力,韓 梅,劉黎瑩,于 洋,張 振,許云賀

(1.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001;2.錦州醫科大學畜牧獸醫學院,遼寧錦州 121001)

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一株乳酸乳球菌的分離鑒定及其發酵豆汁工藝優化

張莉力1,韓 梅1,劉黎瑩1,于 洋1,張 振1,許云賀2,*

(1.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121001;2.錦州醫科大學畜牧獸醫學院,遼寧錦州 121001)

本研究從自然發酵北京豆汁中篩選到一株既可以加速豆汁與淀粉分離又具有優良豆汁發酵性能的乳酸乳球菌乳酸亞種,將其命名為Lactococcuslactissubsp.lactisLLY003。然后以綠豆淀粉的副產物——淀粉上清液為原料,將Lactococcuslactissubsp.lactisLLY003應用于豆汁發酵,通過單因素和正交實驗,確定了發酵豆汁的最佳發酵工藝:在發酵時間為6 h,溫度為39 ℃,6%蔗糖添加量和8%接種量的條件發酵,豆汁的感官評分達到94分,乳酸菌活菌數可以達到3.22×1011CFU/mL。通過保質期實驗,確定發酵豆汁在4 ℃冷藏條件下,保質期至少可達20 d,在保質期內每毫升發酵豆汁的乳酸菌活菌數在一千億以上。

豆汁,綠豆,乳酸菌,發酵

老北京豆汁是一種歷史悠久的傳統發酵食品,以其獨特的風味和豐富的營養深受北京人的喜愛。豆汁是以綠豆為原料,經浸泡、研磨、沉淀、粉漿分離和熬制等工藝得到的一種以酸味為主、摻雜著些許臭味的液體發酵食品[1-3]。在加工過程中,綠豆淀粉的分離與發酵產酸是豆汁加工的關鍵工序,已有研究表明豆汁中的乳酸菌是加速淀粉沉降與發酵產酸的主要微生物[4-5],但是目前仍未有適用于豆汁工業發酵的菌種,所以豆汁生產仍處于初級加工階段,產品質量受自然條件和操作技術等影響大[6-8]。為此本實驗以自然發酵生豆汁為樣品,分別以絮凝率、pH和豆汁發酵風味為指標,篩選出豆汁中具有絮凝淀粉活性的乳酸菌,將其作為豆汁發酵菌株應用于豆汁純種發酵,并優化發酵工藝,提高發酵豆汁的食用安全性和產品質量的穩定性,口味更容易被大多數消費者接受,也為實現發酵豆汁的工業化生產提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆汁 北京東直門豆汁店、隆福寺小吃店、老磁器口豆汁店,于4 ℃手提冰箱中運輸至實驗室,采樣當天進行微生物分離;綠豆 市售食用級;蔗糖、葡萄糖、乳糖、酵母膏、磷酸氫二鉀、乙酸鈉 分析純;綠豆上清液 將綠豆浸泡8～12 h,以豆水比(g/mL)1∶15的比例打漿30 s,過100目篩子,混勻后靜置使淀粉沉淀完全,該上清液即為綠豆淀粉上清液;綠豆汁種子培養基 酵母膏5 g、K2HPO42 g、葡萄糖20 g、蔗糖2 g、乙酸鈉5 g、綠豆上清液1000 mL,調pH至6.8,121 ℃滅菌20 min;綠豆糖水培養液 蔗糖20 g、綠豆上清液1000 mL。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 上海蘇凈實業有限公司;LRH-350F生化培養箱 上海捷呈實驗儀器有限公司;HZQ-F200型振蕩培養箱 上海華鄰實業有限公司;DNA快速提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;TG16K-II臺式高速離心機 濟南福的機械有限公司;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀器廠;UV754PC紫外分光光度計 上海佑科儀表有限公司;JYL-Y99料理機 九陽股份有限公司;OLYMPUS BX53顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆汁中產酸菌的分離純化 采用10梯度稀釋法將老北京豆汁稀釋至10-7,取10-6、10-7的稀釋液各0.1 mL分別注入無菌培養皿中,每個稀釋度做兩個重復。以無菌操作按20～30 g/L的量將滅菌的CaCO3加入熔化了的綠豆汁種子培養基中,使樣品稀釋液和CaCO3均勻分布于培養基中,于30 ℃培養48 h。挑取周圍產生CaCO3的溶解圈的典型單菌落分別接種于綠豆汁種子培養液中,置于30 ℃溫箱中培養24 h。取試管液體培養物1環,進行涂片、革蘭氏染色,油鏡觀察個體形態和純度,同時挑取1環培養液與載玻片上的3% H2O2混勻,視產氣泡情況[9]。將革蘭氏陽性細菌且過氧化氫酶陰性菌株初步鑒定為乳酸菌,分別接種于綠豆汁種子培養基斜面上,30 ℃溫箱中培養48 h后于4 ℃冰箱保存,待下一步篩選。

1.2.2 具有絮凝淀粉活性產酸菌的篩選 從分離到的菌株斜面挑取2環乳酸菌,接種到3 mL綠豆汁種子培養液中,置于30 ℃培養24 h,再將該培養液按5%接種量擴培至綠豆汁種子培養液中,置于30 ℃培養24 h,測定發酵液的絮凝率。

1.2.3 淀粉絮凝率檢測方法 取2.5 mL未接種綠豆汁培養基,加入裝有25 mL綠豆淀粉乳的25 mL刻度試管中,塞上塞子后上下混勻10次,沉淀3 min,在刻度試管的18 cm處取樣測定其540 nm處吸光度值(濁度),取值設為空白值A;同樣方法取2.5 mL菌株發酵液加入裝有25 mL綠豆淀粉乳的25 mL刻度試管中,混勻后在刻度試管的18 cm處取樣測定其540 nm處吸光度值(濁度),取值設為B[10-11]。

綠豆淀粉乳:取浸泡8～12 h的綠豆,按1∶15的比例加水打漿,過120目篩子所得濾液即為綠豆淀粉乳。

式中:A為空白培養基上清的吸光度(濁度);B為樣品上清液的吸光度(濁度)。

1.2.4 豆汁發酵菌篩選 從具有絮凝活性的菌株斜面挑取3環菌,接種到2 mL綠豆糖水培養液中,30 ℃培養24 h,再按5%接種量接入到綠豆糖水培養液中發酵豆汁,30 ℃培養24 h,測定發酵液的pH,并進行發酵豆汁風味評定。

1.2.5 菌種鑒定

1.2.5.1 菌株形態學觀察 將篩選到的菌株接種于綠豆汁種子培養基上,30 ℃培養48 h,觀察菌落形態,并進行革蘭氏染色,莢膜染色,于光學顯微鏡下觀察菌體形態及分裂后菌體間排布方式。

1.2.5.2 菌株的生理生化鑒定 按照《伯杰細菌鑒定手冊》進行菌株的生理生化特性鑒定。

1.2.5.3 菌株16S rDNA序列的測定與分析 DNA的提取:取菌液2 mL,12000 r/min離心2 min,去上清液收集菌體,用天根DNA試劑盒提取DNA。提取后的基因組DNA作為擴增16S rDNA的模板。

16S rDNA 系列擴增:兩個PCR引物分別是:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R:(5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),引物由上海生工(Sangon)合成。

PCR擴增體系:總體積為50 μL,其中27F引物1 μL,1492R引物1 μL,deNTP 1 μL，Pfu Buffer 5 μL,Pfu酶0.25 μL,加水至50 μL。98 ℃預變性5 min,95 ℃變性35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,35個循環后延伸4 min。PCR產物0.8%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色20 min,紫外分析儀檢測。PCR產物純化、16S rDNA序列測定均由上海生工完成。

16S rDNA序列同源性分析:將測定的16S rDNA序列在NCBI核酸數據庫進行BLAST搜索,與數據庫中已有的16S rDNA序列進行相似性比較分析。根據比對結果,找出與數據庫同源性最高的已知菌種,推測待鑒定菌株的可能的屬或種。

1.2.6 豆汁發酵劑的制備 用接種環挑取三環斜面保藏的發酵菌株于5 mL綠豆糖水培養液中,30 ℃下發酵24 h后,將這5 mL發酵液擴大培養,繼續接入50 mL綠豆糖水培養液中30 ℃下發酵24 h,獲得豆汁的發酵劑。

1.2.7 豆汁發酵工藝流程 100 g綠豆→清洗→浸泡(豆水比(g/mL)1∶10,8 h)→沖洗→加水2000 mL打漿30 s(豆水比(g/mL)1∶20)→過濾(100目篩子)→混勻→靜置40 min,按2∶1的比例取上清液和第二層,混勻→加入6%的蔗糖,微加熱使其溶解→滅菌(100 ℃,30 min)→晾涼至20～30 ℃→接入10%的發酵劑→發酵(39 ℃,6 h)→冷藏(4 ℃)。

1.2.8 發酵工藝條件的優化

1.2.8.1 單因素實驗 分別進行接種量(3%、5%、8%、10%、12%、15%)、蔗糖(0%、2%、4%、6%、8%、10%)、培養時間(2、4、6、8、10、12 h)、培養溫度(31、33、35、37、39、41 ℃)的單因素發酵實驗,其他條件同1.2.7,以感官評分為指標,分析各因素對發酵的影響。

1.2.8.2 正交實驗 選取時間、溫度和蔗糖添加量三個因素,以感官評分為指標,作L9(33)正交實驗確定最佳發酵工藝條件(表1)。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

表3 乳酸菌發酵液絮凝率、pH及發酵風味Table 3 Flocculating rate,pH and flavor of the fermentation by lactic acid bacteria

注:同行數據之間肩標字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

表4 乳酸菌個體形態特征Table 4 Individual morphology of lactic acid bacteria

1.2.8.3 感官評定 感官評定在錦州醫科大學食品微生物實驗室完成,邀請10人組成評定小組,明確本實驗的目的和意義以及感官評定的指標和注意事項。本實驗采用隨機雙盲法進行檢驗(即對樣品進行編號,檢驗樣品也隨機化),旨在減少如個人嗜好與偏愛、經驗等因素對檢驗結果的影響。評定分數采用 3 個分制,分別對不同的情況進行打分。每名成員單獨進行評分,不互相交流,評定下一個樣品之前要用清水漱口。取10名成員的平均分作為最后的結果。發酵豆汁感官評分標準詳見表2。

表2 發酵豆汁感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of fermented beverage of mung bean

1.2.9 數據處理 原始數據采用Excel 2007整理,采用SPSS 19.0 進行ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(p<0.05),數值以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 豆汁發酵菌株篩選

淀粉的分離與發酵產酸是加工豆汁的關鍵工序,因此本研究以檢測淀粉沉降分離速度的絮凝率、發酵產酸的pH和豆汁發酵風味為指標篩選豆汁發酵菌株。分別從三個不同來源的老北京豆汁樣品中共選取56株有碳酸鈣溶解圈的產酸菌株,其中革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株有16株,初步鑒定為乳酸菌;然后分別測定這16株菌發酵液的絮凝率,有8株菌的絮凝率高于50%,結果見表3,其中3株為球狀乳酸菌、5株為桿狀乳酸菌,而且不論是桿狀產酸菌還是球狀產酸菌菌體分裂后的排布方式均為鏈狀(表4)。

將上述具有絮凝活性的乳酸菌接入到綠豆糖水培養液中發酵豆汁,30 ℃培養24 h,發酵液的pH及豆汁風味見表3。5株桿狀的乳酸菌發酵后的豆汁pH都低于4,且發酵豆汁普遍具有發酵酸腐味,而3株球菌發酵后的酸味較柔和,在3株球狀乳酸菌中以LLY003菌株絮凝率最高,即加速淀粉沉降分離速度最快,因此選擇LLY003菌株作為豆汁發酵菌種,并對其進行菌種鑒定。

2.2 LLY003菌株的鑒定

2.2.1 LLY003菌株的個體形態與菌落形態 LLY003菌株在綠豆汁種子培養基培養,30 ℃培養48 h的菌落圖片及菌落特征見圖1和表5。

表5 LLY003菌株的形態特征Table 5 Individual morphological characters of strain LLY 003

表6 LLY003菌株的菌落形態特征Table 6 Colonial morphology characters of strain LLY 003

圖1 綠豆汁種子培養基中菌株LLY003菌落形態Fig.1 Colonial morphology of strain LLY003 on green bean juice seed solid medium

LLY003菌株在豆汁種子培養基中,30 ℃下培養48 h,觀察菌落大小、形態和顏色,結果見圖2和表6。

圖2 菌株LLY003的個體形態(×1000)Fig.2 Individual morphology of strain LLY003(×1000)

2.2.2 LLY003的生理生化特征 根據常規生理生化鑒定,結果見表7,參照《伯杰細菌鑒定手冊》,初步判斷菌株LLY003為乳球菌屬。

表7 LLY003菌株生理生化特性Table 7 Physiology biochemistry characteristics of strain LLY003

注:+表示陽性,-表示陰性。

2.2.3 乳酸菌LHY03的16S rDNA序列分析結果 該菌株的16S rDNA 序列全長共1466 bp,經Genbank比對相似性達到99.8%;通過菌體的群體形態觀察、個體形態觀察、生理生化實驗結果及菌株的16S rDNA序列比對,確定該菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種,命名為Lactobacilluslactissubsp.lactisLLY003,已于2016年7月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No. 12795。

2.3 單因素實驗優化發酵工藝實驗

2.3.1 不同接種量對豆汁發酵工藝的影響 適當提高接種量可以縮短微生物生長的延滯期,減緩菌株發酵產酸的速度,由圖3可知,感官評分隨接種量的增多而不斷增大,當接種量達到8%時,感官評分達到最高值92分,之后隨接種量的增加,豆汁感官質量差異不顯著,考慮增加接種量會提高豆汁生產成本,因此選擇8%的接種量。

圖3 接種量對豆汁發酵的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the fermentation of mung bean beverage注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05),圖4～圖6同。

2.3.2 不同蔗糖添加量對豆汁發酵工藝的影響 蔗糖作為碳源,在一定濃度范圍,菌體的生長及發酵產酸速度隨著蔗糖含量的增加而加快,由圖4可知,蔗糖的添加量在6%～8%時,豆汁發酵風味的感官評分較高,因為蔗糖含量過高會增大培養液的滲透壓,抑制菌體生長,另外甜度過高對人體健康不利,因此選擇6%的蔗糖添加量。

圖4 蔗糖添加量對豆汁發酵的影響Fig.4 Effect of sucrose on the fermentation of mung bean beverage

2.3.3 發酵時間對豆汁發酵工藝的影響 由圖5可知,發酵時間的長短對豆汁風味的影響較大,在6 h之前,感官評分隨時間增多而增大,培養時間過短,菌體生長不充分,乳酸菌發酵蔗糖產酸量不足,發酵豆汁偏甜、酸爽感不足。在培養6 h時,感官評分達到最高分90分。之后,隨著發酵時間的延長、乳酸菌產酸量增大,酸度增加,影響口感,豆汁感官評分減小,因此發酵時間選擇6 h。

圖5 培養時間對豆汁發酵的影響Fig.5 Effect of culture time on the fermentation of mung bean beverage

2.3.4 不同培養溫度對豆汁發酵工藝的影響 由圖6可知,培養溫度低于35 ℃時,隨著溫度的提高,豆汁感官評分增加,這可能是由于溫度較低時,微生物生長速率低及發酵產酸少,風味口感欠佳。在35～39 ℃之間,感官評分緩慢增長,39 ℃時達到最高分數93分,之后評分下降,因此選擇39 ℃作為豆汁的最佳發酵溫度。

圖6 培養溫度對發酵工藝的影響Fig.6 Effect of culture temperature on the fermentation of mung bean beverage

2.4 正交實驗

通過正交實驗表可以看出,對發酵影響最大的因素是發酵時間,其次是發酵溫度和蔗糖添加量。根據結果表明,最佳培養條件組合為A2B3C2。在發酵時間為6 h,溫度為39 ℃,蔗糖添加量為6%的條件下進行驗證實驗,感官評分達到94分,乳酸菌活菌數可以達到3.22×1011CFU/mL。

表8 正交實驗結果Table 8 Results of orthogonal experiment

2.5 保質期實驗

如表9所示,發酵豆汁的保質期實驗以其pH、乳酸菌活菌數及感官評分為檢測指標,在實驗期間,豆汁在4 ℃低溫下保藏20 d活菌數幾乎沒有下降,pH略有降低,感官質量也沒有顯著降低,因此,確定發酵豆汁在4 ℃低溫下,保質期至少可以達到20 d,且在保質期內發酵豆汁的乳酸菌活菌數在1011CFU/mL以上,其活菌數量高于市場上同類產品活菌數的100倍以上[12-15]。

表9 保質期實驗結果Table 9 Results of shelf life

注:同列數據之間肩標字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

3 討論

一般發酵飲料發酵劑的接入量為3%～8%[12-13],結合實驗結果,本實驗最適接種量取8%。適當的添加蔗糖對發酵飲料的口感給予保證,也為菌種的生長提供碳源,糖濃度過低會使口感過酸,也可使生長中的菌種由于缺少碳源而生長不充分;而糖濃度過高會使口感過甜,滲透壓過大反而抑制菌種生長[14],本實驗中蔗糖添加量為6%時達到最高感官得分93分,因此6%為最適蔗糖添加量;培養時間過短,使菌種生長不充分,發酵飲料口感不佳。培養時間過長,可能會帶來其他雜菌的生長,使口感過酸或對人體健康不利。因此由實驗得知6 h為最適培養時間;實驗得知,培養溫度過高或過低都不利于該菌種的生長,39 ℃為最適培養溫度。對發酵時間、發酵溫度和蔗糖添加量進行正交實驗,得出最佳發酵條件為發酵時間為6 h,溫度為39 ℃,蔗糖添加量為6%。并在此條件下進行驗證實驗,感官評分達到94分,乳酸菌活菌數達到3.22×1011CFU/mL。

對發酵的產品進行保質期實驗,在實驗的20 d期間,樣品在4 ℃低溫下保藏20 d活菌數幾乎沒有下降,pH略有降低,感官品質沒有下降,因此,確定發酵豆汁在4 ℃低溫下,保質期至少可以達到20 d,在保質期內發酵豆汁的乳酸菌活菌數在1011CFU/mL以上。其活菌數量高于市場上同類產品活菌數的100倍以上[15]。本開發的發酵豆汁中除了蔗糖外,未添加任何食品添加劑,保證豆汁的營養價值和原有的風味,且生產成本低;純種發酵的豆汁營養性、安全性和穩定性都較高,口感也更容易被大眾所接受,本研究對豆汁的產業化開發具有指導意義。

4 結論

本文以自然發酵老北京豆汁為樣品,從中篩選到一株既可以加速豆汁與淀粉分離又具有優良豆汁發酵風味的乳酸乳球菌乳酸亞種,將其命名為Lactobacilluslactissubsp.lactisLLY003。將該菌株應用于豆汁發酵,通過單因素和正交實驗,確定了豆汁的最佳發酵工藝,在發酵時間為6 h,溫度為39 ℃,6%蔗糖添加量和8%接種量的條件發酵,豆汁的感官評分達到94分,乳酸菌活菌數可以達到3.22×1011CFU/mL。發酵豆汁在4 ℃下冷藏,在20 d保質期實驗期間,樣品的pH和感官評分變化不大,且發酵豆汁的乳酸菌活菌數仍在1011CFU/mL以上,發酵豆汁的保質期至少可以達到20 d,本研究將為豆汁的工業化生產提供技術參考。

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Isolation and identification ofLactococcuslactisand process optimization in fermented beverage of mung bean

ZHANG Li-li1,HAN Mei1,LIU Li-ying1,YU Yang1,ZHANG Zhen1,XU Yun-he2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China; 2.College of Animal Husbandry & Veterinary Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China)

A strain ofLactococcuslactissubsp.lactiswith accelerating the separation of starch and good fermentation properties was isolated from Beijing Douzhi by natural fermentation. This strain was namedLactococcuslactissubsp.lactisLLY003 and applied to fermentation beverage and the supernatant of mung bean starch as substrate. Then the single factor experiment and orthogonal experiment were designed for optimizing the technology parameters. The optimal fermentation condition was inoculated amount 8% at 39 ℃ for 6 hours with 6% aucrose,under these conditions,the values of sensory reached 94 scores and the viable cells reached 3.22×1011CFU/mL. The storage shelf life could reach up to 20 days at 4 ℃ and the viable cells above one hundred billion.

beverage of mung bean;mung bean;lactic acid bacteria;fermentation

2017-01-13

張莉力(1977-)，女，博士，副教授，主要從事食品微生物研究，E-mail：13634967549@163.com。

*通訊作者:許云賀(1978-)，男，博士，副教授，主要從事畜牧微生物應用研究，E-mail：sn_97@126.com。

國家自然科學基金項目(31301499)；遼寧省自然科學基金項目(2014022052)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0134-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.017