馬鈴薯淀粉汁水中Patatin的純化及結構研究

孫 瑩,魏冬旭,姚春艷,江連洲

(1.哈爾濱商業大學旅游與烹飪學院,黑龍江哈爾濱 150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術中心,黑龍江哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業大學經濟學院,黑龍江哈爾濱 150000;4.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

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馬鈴薯淀粉汁水中Patatin的純化及結構研究

孫 瑩1,魏冬旭2,姚春艷3,江連洲4

(1.哈爾濱商業大學旅游與烹飪學院,黑龍江哈爾濱 150000;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局技術中心,黑龍江哈爾濱 150001;3.哈爾濱商業大學經濟學院,黑龍江哈爾濱 150000;4.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

馬鈴薯淀粉汁水經分離與純化后得到馬鈴薯糖蛋白Patatin。通過對Patatin純度、結構的測定與分析表明:Patatin純度在90%以上,分子量為40.6 kDa。Patatin是糖和蛋白質的復合物。單糖組成為:鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。Patatin中含有α-糖苷鍵,糖苷類型為吡喃型;糖鏈和肽鏈之間由O-型糖肽鍵連接。Patatin的熱變性溫度為75 ℃。

馬鈴薯淀粉汁水,Patatin,純化,結構

馬鈴薯汁水是馬鈴薯淀粉加工過程中產生的一種副產物,主要成分是馬鈴薯蛋白。馬鈴薯蛋白是一種全蛋白,其賴氨酸和色氨酸均高于谷類作物,營養價值可與雞蛋蛋白相媲美。如果將馬鈴薯汁水直接排放,不僅造成環境污染,而且還會造成優質蛋白質資源的浪費[1]。

Patatin占馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白的40%左右[2]。Patatin是馬鈴薯塊莖中主要的貯藏蛋白,與其他貯藏蛋白不同的是Patatin具有酶活性[3-5]。正是由于Patatin在馬鈴薯塊莖中含量較高并且具有酶活性,所以引起了研究者的廣泛興趣。

本研究以馬鈴薯汁水為原料,通過超濾膜分離技術對汁水進行預處理得到馬鈴薯濃縮蛋白質,再利用色譜分離技術對濃縮蛋白進行純化,最終得到糖蛋白Patatin。分析了Patatin的純度、單糖組成和熱穩定性以及多糖的糖鏈構型,以期為進一步研究馬鈴薯糖蛋白Patatin結構與活性功能的關系提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯汁水 內蒙古華歐淀粉廠;Con A-Sepharose 4B和Q-Sepharose Fast Flow 美國GE Healthcare公司;三氟乙酸(TFA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)和考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司;其他試劑為分析純。

PYRIS-1差示掃描量熱儀 英國Perkin Elmer公司;F-4500型熒光分光光度計 日本日立公司;Bruker核磁共振儀 德國Bruker公司;Nexus 470傅立葉變換紅外光譜儀和LCQ Decaxp電噴霧質譜 美國Thermo electron公司;Mini Protein Ⅱ電泳儀 美國Bio-Rad公司;GC-2010氣相色譜質譜聯用儀 日本島津公司;Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司;AKTA層析系統 美國GE公司;Autoflex Ⅲ飛行時間質譜 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬鈴薯濃縮蛋白粉的制備 將收集新鮮的馬鈴薯汁水靜置沉淀,撇去表面的泡沫后用300目和5 μm的濾袋過濾兩次,得到的液體用MWCO 200 kDa超濾膜進行過濾,收集膜分離后所得截留液,最后將截留液進行干燥得馬鈴薯濃縮蛋白粉,備用[11]。

1.2.2 離子交換柱層析 將超濾截留液干燥后得到的馬鈴薯濃縮蛋白粉進行色譜分離。稱取三份200 mg超濾濃縮蛋白粉分別用pH7的5 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解,然后在10000 r/min轉速下離心30 min,取上清液上離子交換Q-Sepharose Fast Flow(1.6 cm×25 cm)柱,用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(溶解樣品時的pH)平衡,收集離子交換穿透峰,再用平衡液沖洗5個柱體積,然后用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)B液洗脫。100% B液直接洗脫。收集離子交換洗脫液。流速為1.5 mL/min。在280 nm下檢測吸光度。

1.2.3 親和層析 將離子交換洗脫液濃縮后,上Con A-Sepharose 4B(2.6 cm×20 cm)柱。用含1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡,少量未吸附蛋白穿透,然后用1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡5個柱體積后,改用含0～100 mmol/Lα-甲基-D-葡萄糖苷和1 mol/L NaCl 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)C液洗脫。流速為1.5 mL/min。在280 nm下檢測吸光度。收集親和層析洗脫液,5000 Da超濾離心管離心10 min,干燥后存于-20 ℃冰箱中,備用。

1.2.4 電泳(SDS-PAGE) 用樣品溶解液(內含4% SDS、10%β-巰基乙醇、20%甘油、0.02%溴酚藍、0.125 mol/L Tris-HCl緩沖液,pH6.8)配制濃度為1 mg/mL蛋白質溶液,振蕩混合1 min,100 ℃水浴3 min,備用。參照Park[12]的SDS不連續電泳方法,分離膠濃度15%,濃縮膠濃度5%,電極緩沖液含0.05 mol/L Tris、0.384 mol/L甘氨酸、0.1% SDS(pH8.3)。電泳采用1.00 mm凝膠板;上樣量為12 μL;開始電泳時電壓為90 V,待樣品進入分離膠后改為130 V;電泳結束后,取出膠片先用固定液固定30 min,再用考馬斯亮藍R250染色30 min(染色液含有50%的甲醇、6.8%的冰醋酸和1 mg/mL的考馬斯亮藍),然后用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明(脫色液中含有5%的甲醇和7.5%的冰醋酸)。

1.2.5 凝膠過濾色譜 采用凝膠過濾色譜法分析Patatin的純度。色譜柱:Sephadex G-75(30 cm×1.6 cm);流動相:磷酸緩沖液(0.02 mol/L,pH7.0);流速:0.5 mL/min;檢測波長:280 nm;進樣量:2 μL。

1.2.6 液質聯用(HPLC-MS)技術對純化組分進行定性 參照張貴鋒[13]和高建萍[14]等人的方法。將收集的離子交換洗脫液和親和層析洗脫液經過3000 Da和5000 Da的超濾離心管10000 r/min離心10 min。在100 ℃加熱處理10 min后進行真空干燥,將干燥粉溶解在200 μL 0.05 mol/L NH4HCO3溶液中(pH8.0),再加入50 μL 1 μg/μL胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶溶解在0.05 mol/L NH4HCO3,pH8.0),渦旋混合均勻,37 ℃加熱8 h得到酶解后的產物再用液質聯用(HPLC-MS)分析。液質聯用分析條件:選用的色譜柱為Zorbax SB C18(150 mm×2.1 mm);流動相 D液含 0.1% TFA的水溶液;流動性E液含0.1% TFA的乙腈;進樣量50 μL。梯度設置0～10 min,10% E;10～70 min,10%～90% E;80～90 min,100% E。通過Turbosequest軟件進行質譜數據檢索,從Swiss-Prot網站上下載包括馬鈴薯蛋白中已發現的全部蛋白質氨基酸序列數據庫。檢索參數設置為:多肽質荷比范圍設為m/z=300～2000;多肽的信號強度為1×105;多肽的分子量計算方式為單一同位素分子量;FASTA數據搜索格式;±1.5多肽質量準確度;±1.0碎片離子的質量準確度。陽性結果:當多肽帶電荷數1時,Xcorr≥1.5,帶電荷數為2時,Xcorr≥2.0,帶電荷數為3時,Xcorr≥2.5,DeltaCn≥0.1。綜合考慮目標離子色譜峰的信噪比以及二級質譜圖b、y離子之間的匹配性和連續性。

1.2.7 純化樣品分子量測定 取1 μL樣品點靶,室內自然風吹干后取1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質溶液點靶,自然風干。質譜質量數利用外標法,并用標準蛋白混合物校正。以337 nm脈沖氮激光離子解析電離源,100 次/s激光脈沖次數,20 kV離子加速電壓,m/z 600～4000范圍內掃描[14]。

1.2.8 蛋白質和碳水化合物含量測定 蛋白質含量測定依照Bradford法[15],標準蛋白采用牛血清白蛋白;碳水化合物含量測定依照苯酚-硫酸法測定,標準單糖采用葡萄糖。

1.2.9 氣相色譜分析Patatin單糖組成 取10 mg Patatin置于安培管中,加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸,封管后120 ℃水解6 h。冷卻至室溫,減壓蒸干。加入約10 mg鹽酸羥胺及1 mL無水吡啶,90 ℃反應30 min,冷至室溫,加入1 mL無水醋酸酐,90 ℃下反應30 min,冷至室溫,再用氯仿萃取3次,每次1 mL,合并氯仿層,減壓抽干,置真空干燥箱減壓干燥24 h[16-17]。各種標準單糖的糖腈乙酰酯衍生物制備方法同上,分別進行氣相色譜分析。采用日本島津GC-2010氣相色譜儀,氫火焰離子化檢測器,載氣N2流速為20 mL/min,氫氣流速為40 mL/min,空氣流速為450 mL/min,色譜柱為Rtx-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),程序升溫,柱初溫180 ℃,恒溫3 min,升溫速率為5 ℃/min,終溫240 ℃,恒溫3 min,進樣口溫度為280 ℃,檢測器溫度為250 ℃。

1.2.10 Patatin熱性能 通過示差掃描熱量計(DSC)測定蛋白熱穩定性。精確稱量15 mg樣品放入樣品池,放置DSC儀器的樣品支持器上,調整好儀器,用空盒做對照。實驗采用的測定溫度范圍為0～200 ℃,加熱速度為10 ℃/min[18-19]。

1.2.11 紅外光譜 稱取干燥的Patatin 1 mg和100 mg KBr固體粉末在瑪瑙研缽中均勻研磨,用壓片機壓成薄片,用紅外分光光度計在4000～400 cm-1范圍進行掃描[20]。

1.2.12 核磁共振 將10 mg Patatin溶解在1 mL D2O中,冷凍干燥交換3次。用0.5 mL D2O溶解后置于核磁管,于250 ℃核磁共振波譜儀測定其1H NMR和13C NMR[21-22]。

1.3 統計分析

采用SPSS 12.0數據統計軟件對實驗數據進行單因素方差分析;采用Origin8.0作圖,每個實驗重復三次,結果用平均數±SD表示。

2 結果與分析

2.1 色譜層析

馬鈴薯濃縮蛋白經過Q-Sepharose Fast Flow離子交換色譜柱后得到兩個峰(見圖1)。收集的離子交換洗脫液(圖1中的洗脫峰),經過濃縮后,直接上Con A-Sepharose 4B親和色譜柱,上樣后用緩沖液B平衡,收集穿透液。然后用含1 mol/L NaCl和1 mol/L葡萄糖酸酐20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7)C洗脫吸附在介質上的組分,收集洗脫液。

圖1 馬鈴薯濃縮蛋白離子交換色譜Fig.1 Ion exchange chromatography of potato concentrated protein

2.2 Patatin純度鑒定

收集的親和層析洗脫液經過SDS-PAGE和Sephadex G-75凝膠過濾檢測,以判斷樣品的純度。通過SDS-PAGE分析可知,親和層析洗脫峰組分為單一組分,電泳顯示單一條帶,達到電泳純(圖2A)。

純品純度檢測一般要用兩種以上的方法檢測,因此選用凝膠過濾進行驗證。通過Sephadex G-75凝膠過濾分析發現譜圖上出現一個細而尖的峰,通過峰面積估算,該組分的純度在90%以上(圖2B)。

圖2 Patatin的純度Fig.2 Homogeneity assays of purified patatin

2.3 純化樣品的組分鑒定

利用超濾和色譜分離相結合的方法對馬鈴薯汁水中的蛋白質組分進行分離,通過SDS-PAGE初步判斷出親和層析洗脫峰蛋白質主要集中在40 kDa左右。在此基礎上采用HPLC/MS與酶解技術相結合的方法對親和層析洗脫峰中的蛋白質進行識別。

圖3為親和層析洗脫峰中樣品經過酶解、HPLC/MS分析的總離子流圖,質譜數據利用Turbosequest軟件進行數據庫檢索以識別洗脫峰中的組分。

圖3 洗脫峰的紫外色譜(A)和總離子流(B)Fig.3 Total ion chromatograms(TIC)of digested unbound fraction

表1結果表明,洗脫峰中蛋白質主要為Patatin,并且含有多種亞基,分別為Patatin-01、Patatin-04/09、Patatin-3-Kuras 1、Patatin-03和Patatin-2-Kuras 3。Pots等[23]分離出的Patatin 具有兩種亞基,分子量分別為40.5 kDa和41.8 kDa。不同亞基類型的Patatin在氨基酸組成及排列順序方面有輕微差異,但卻具有相同的免疫和色譜性質,因此,通常將不同亞基類型的Patatin作為均一蛋白來進行研究[24]。這一結果與SDS-PAGE和Sephadex G-75凝膠過濾檢測結果一致,表明該組分是均一物質,可進一步結構分析。

表1 親和層析洗脫峰組分識別結果Table 1 Identification of unbound fraction of affinity chromatography

2.4 馬鈴薯糖蛋白Patatin的分子量

通過MALDI-TOF-MS分析馬鈴薯糖蛋白Patatin的精確分子量,結果如圖4所示。由圖4可知,通過親和層析色譜純化得到的Patatin分子量為40.6 kDa,其多電荷亞基分子量分別為10.1、13.6、20.3 kDa。這個結果與HPLC-MS分析結果存在差異。Jorgensen等[25]通過MALDI-TOF-MS檢測純化出的Patatin分子量為41～42 kDa,通過肽指紋圖譜分析發現Patatin中含有三種亞基,分別為Pat2-K1、Pat3-K1和Pat1-K2,分子量約為40 kDa。同樣,與本文結果也存在差異。這可能與儀器的精密度有關系。另外,MALDI-TOF-MS圖中的峰分子量是通過標尺手動標上,所以存在一定的誤差。

圖4 馬鈴薯糖蛋白Patatin的分子量Fig.4 Molecular weight of potato glycoprotein Patatin

Liu等[26]從馬鈴薯塊莖中提取出的Patatin(45 kDa)分子量與本文報道的Patatin分子量(40.6 kDa)差異很大。這兩種Patatin可能是不同的亞基類型,馬鈴薯的品種以及提取方式不同可以引起亞基組成不同[23]。

2.5 馬鈴薯糖蛋白Patatin的理化性質

2.5.1 馬鈴薯糖蛋白Patatin糖、蛋白質含量、單糖組成分析 用苯酚-硫酸法測定糖蛋白Patatin中糖的含量約為32%,用Bradford法測定其蛋白質含量約為64%,說明Patatin是糖和蛋白的復合物。

通過氣相色譜法分析Patatin的單糖組成。圖5為標準混合單糖和Patatin氣相色譜圖。在標準混合單糖中,1、2、3、4、5、6分別為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖;在Patatin樣品中1、2、3、4 分別為鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖。由圖5A可知,采用糖腈乙酰酯衍生化方法可以使一種單糖對應一種衍生化產物,在本實驗條件下,可以將混合標準單糖較好的分離。圖5B是用同樣的衍生化方法并在相同的測定條件下得到Patatin水解衍生化產物的氣相色譜圖,從圖5B中可以看出,通過與標準混合單糖的保留時間比較可知,Patatin中可能含有四種單糖,分別為鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。對于Patatin的單糖組成,國內沒有相關報道,國外僅有Racusen等人[2]通過紙層析法測得45 kDa Patatin主要單糖為甘露糖,正是由于甘露糖的出現,使Patatin對甘露糖具有高度的親和力,使Patatin能夠吸附到Con A-Sepharose 介質上。Tsukagoshi等[27]報道了從Coriolus versicolor中提取的PSK糖蛋白具有抗腫瘤活性,原因可能是它的結構中包括的葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖發揮作用。研究Patatin中含有的單糖組分可為研究Patatin的生理活性提供理論依據。

圖5 標準混合單糖(A)和Patatin(B)氣相色譜Fig.5 Gas chromatography spectrum of standard mixed monosaccharides(A)and patatin(B)

2.5.2 馬鈴薯糖蛋白Patatin的糖肽鍵特征 單糖與蛋白質中某一肽段的連接是糖蛋白的重要結構特征。目前已經發現多種連接方式,其中主要有兩類:一類是糖鏈與天冬酰胺連接,稱為N-連接糖肽鍵,另一類是與蘇氨酸和絲氨酸連接,成為O-連接糖肽鍵。β-消去反應可以區分糖蛋白中的O-糖肽鍵和N-糖肽鍵。O-糖肽鍵在堿作用下易發生斷裂,而N-糖肽鍵相對比較穩定。糖蛋白經過堿處理后,與O-糖肽鍵連接的蘇氨酸生成α-氨基丁烯酸,絲氨酸生成α-氨基丙烯酸,形成的不飽和氨基酸在240 nm波長處的紫外吸收明顯增強,在反應體系中迅速加入硼氫化鈉還原劑,α-氨基丙烯酸會被還原成丙氨酸。因此,在β-消去反應中,絲氨酸和蘇氨酸的含量減少,而丙氨酸和α-氨基丁酸的含量,減少和增加之間有一定的聯系[17-18]。

圖6為Patatin經過NaOH溶液處理前后的紫外吸收光譜。Patatin經過β-消去反應后,糖鏈被消去,235 nm處吸光度明顯增加。說明馬鈴薯糖蛋白Patatin糖肽鍵為O-連接糖肽鍵。

圖6 β-消去反應前后Patatin的紫外光譜Fig.6 UV spectra of patatin before and after β-eliminate reaction

2.5.3 馬鈴薯糖蛋白Patatin的熱穩定性 蛋白質在加熱過程中,內部氫鍵斷裂,導致蛋白質分子伸展,在分子伸展過程中需要吸收熱能,這種現象被稱為熱變性。蛋白質的熱變性和可能影響蛋白質生理活性的空間構象的變化有緊密的關系。DSC可以反映蛋白質的空間構象變化,熱穩定性與生理功能之間的關系及熱變性原因等信息,被廣泛用于蛋白質的熱變性研究中[28]。因此,通過測定β-消去反應前后糖蛋白Patatin的DSC,可以確定糖鏈對其抗熱變性功能的影響強弱。

糖蛋白Patatin的熱變性最高溫度為74.97 ℃,經過β-消去反應后,其熱變性最高溫度降低為66.98 ℃(表2)。β-消去反應使糖鏈釋放,導致熱變性溫度明顯降低,說明糖鏈對Patatin穩定性起到重要作用,并且糖鏈的存在可以提高Patatin的抗變性能力。

表2 Patatin(A)和β-消去反應后Patatin(B)的DSC結果Table 2 The result of DSC on patatin(A) and Patatin treatmented by β-elimination(B)

2.5.4 馬鈴薯糖蛋白Patatin的核磁共振(NMR)分析 Patatin的13C NMR和1H NMR如圖7所示。呋喃型醛糖的C-4和呋喃型酮糖C-5在δ 82.00～84.00 ppm 范圍內有信號,這個原則用于區別呋喃糖和吡喃糖構型。在圖7A中,δ 82.00～84.00 ppm內沒有信號,說明Patatin為吡喃構型。一般來說,吡喃糖的α構型在δ 90.00～102.00 ppm有信號,β構型在δ 102.00～112.00 ppm有信號,Patatin在101.29 ppm出現信號峰,表明其糖苷鍵構型為α-型,進一步證明了Patatin糖苷鍵主要類型為α-型吡喃糖[29-30],與紅外圖譜分析結果一致。

在圖7B中,質子信號對應不同的糖殘基。δ 5.18、δ 5.09、δ 4.98、δ 4.53 ppm分別對應H-1的α-(1→3)甘露糖,α-(1→4)半乳糖,β-(1→4)葡萄糖和α-(1→2)鼠李糖。許多文獻已經報道[31],單糖組成和糖苷鍵類型可能與糖蛋白的抗腫瘤活性相關。

圖7 馬鈴薯糖蛋白Patatin的13C NMR譜(A)和1H NMR譜(B)Fig.7 13C NMR spectra of Patatin(A) and1H NMR spectra of Patatin(B)

3 結論

通過離子交換和親和層析分離技術相結合的工藝技術對馬鈴薯濃縮蛋白進行純化,得到馬鈴薯糖蛋白Patatin。經過SDS-PAGE和Sephadex G-75凝膠過濾檢測,親和層析洗脫峰組分的純度在90%以上。MALDI-TOF-MS鑒定該組分是分子量為40.6 kDa的Patatin。Patatin為糖和蛋白質的復合物,其單糖組成為:鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖;Patatin中含有α-糖苷鍵,糖苷類型為吡喃型;Patatin經過β-消去反應前后的紫外光譜測定表明:糖鏈和肽鏈之間由O-型糖肽鍵連接。Patatin的熱變性溫度為74.97 ℃,經過β-消去反應后,熱變性溫度為66.98 ℃。

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Study on purification and structure of Patatin from potato starch juice

SUN Ying1,WEI Dong-xu2,YAO Chun-yan3,JIANG Lian-zhou4

(1.College of Tourism and Culinary Science,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;2.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;3.College of Economics,Harbin University of Commerce,Harbin 150000,China;4.College of food,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Potato glycoprotein(patatin)was obtained by separating and purifying the potato starch juice. The results showed that the purity of patatin was above 90% and the molecular weight was 40.6 kDa. Furthermore,the monosaccharide composition included rhamnose,mannose,glucose and galactose. Moreover,the carbohydrate chain of patatin was connected to protein by O-glycopeptide linkages and denaturation temperature of patatin was 75 ℃.

potato starch juice;Patatin;purification;structure

2016-11-18

孫瑩(1982-)，女，博士，講師，研究方向：植物蛋白質的功能性，E-mail:sunying625@163.com。

黑龍江省自然科學基金項目(C2015067)；哈爾濱商業大學博士科研啟動項目(15RW19);哈爾濱商業大學青年人才支持項目(2016QN060)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)11-0122-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.015