響應面法優化多汁乳菇多糖提取工藝及抗氧化活性研究

黃 娟，黃燕燕，劉冬梅，*，陳素芹，潘偉才

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640;2.深圳市大百匯技術有限公司,廣東深圳 518081)

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響應面法優化多汁乳菇多糖提取工藝及抗氧化活性研究

黃 娟1，黃燕燕1，劉冬梅1，*，陳素芹2，潘偉才2

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640;2.深圳市大百匯技術有限公司,廣東深圳 518081)

多汁乳菇,多糖,提取,響應面,抗氧化活性

多汁乳菇(LactariusvolemusFr.),俗名牛奶菇,是可食用的野生真菌,隸屬于擔子菌綱、傘菌目、紅菇科、乳菇屬,是樹木的外生菌根菌,由于其獨特的風味而被廣泛地應用于煙草及食品中[1-3]。研究發現,多汁乳菇含16種氨基酸,總量為14335.3 mg/100 g,其中8種為人體必需氨基酸,含量為5938. 2 mg/100 g,含有Si、Fe、Na、Zn、Mg、Mn、Cu、Al、Ti等多種人體必需的礦物質元素且其水提物可以增強人體免疫力、對小白鼠肉瘤S-180、艾氏癌的抑制率分別達到了80%和90%[4-6]。

大量研究表明多糖具有廣泛的抗菌、抗氧化、抗疲勞、降血糖血脂、抗病毒、抗癌等生理活性,但多汁乳菇多糖(Lactariusvolemuspolysaccharide,LVP)作為一種新型活性物質,卻鮮少有關于其提取工藝、化學結構、構象、構效關系、生理活性等方面的報道[7-8]。多糖的提取方法較多,常見的有酶提法、水提法、酸提法、堿提法、微波輔助及超聲波輔助法[9]。酶制劑價格昂貴,不適宜工業制備應用;酸提和堿提會對多糖的活性造成一定的破壞作用;雖然水提法費時長、耗能高,但其能最大程度地保護多糖的生物活性;微波和超聲波輔助是一種新型的輔助技術。近年,超聲波技術廣泛應用于天然活性物質的提取,可節省浸提溶劑,提高效率,已經被國內外很多提取工業應用[10]。目前,國內外有關應用超聲波技術對 LVP提取及抗氧化活性的研究報道較少,目前僅張水花[8]等人通過正交設計法優化了多汁乳菇多糖的微波輔助提取工藝并對多汁乳菇多糖的DPPH自由基清除活性進行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多汁乳菇干子實體 云南市場采購;無水乙醇 廣州卯林儀器有限公司;抗壞血酸(VC)、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、H2O2、焦棓酸、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、FeSO4、水楊酸、過硫酸鉀 廣州藍澤生物科技有限公司(所有試劑均為分析純)。

RT-25超細粉碎機 上海比儀器制造有限公司;RE-5299旋轉蒸發儀 上海亞榮儀器有限公司;SJIA-10N冷凍干燥機 寧波市雙嘉儀器源頭廠家;7200紫外分光光度計 尤尼克(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多汁乳菇多糖的提取與精制 多汁乳菇干子實體粉碎過200目篩→無水乙醇、石油醚90 ℃下回流脫除脂溶性成分→抽濾→濾渣烘干→100 W超聲波輔助提取10 min[10]→離心取濾液→減壓蒸發濃縮→乙醇過夜沉淀→離心得粗多糖沉淀→75%乙醇洗滌沉淀→復溶于水→(單因素實驗檢測用的多糖樣品溶液Y1)→Sevag試劑(正丁醇∶氯仿=1∶4(v/v))除蛋白→離心取上層多糖水相→二次醇沉→離心→洗滌多糖沉淀→復溶于少量水→真空冷凍干燥→復溶于水→離心除不溶物→多汁乳菇多糖精品Y2。

1.2.2 多汁乳菇多糖檢測方法

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 參照文獻采用苯酚-硫酸法[11]完成,得到葡萄糖標準曲線方程:y=8.4986x-0.0186,y表示糖溶液在490 nm下的吸光值,x表示糖溶液的濃度,在0～0.05 mg/mL范圍內,其線性相關系數為0.9902。

1.2.2.2 多汁乳菇多糖測定 移取少量的1.2.1中所述的Y2溶液,分別采用I2-KI、α-萘酚對淀粉及多糖進行檢測驗證,并采用凱氏定氮法[12]對多糖粗品中的蛋白質含量進行檢測,采用上述苯酚-硫酸法對Y1和Y2樣品中的多糖含量進行檢測,分別按式(1)和式(2)計算多糖得率和多糖的純度。

多糖得率(%)=c1n1V1/m×100

式(1)

多糖純度(%)=c2V2/m1×100

式(2)

其中,c1為Y1樣品稀釋液對應的多糖濃度(mg/mL),V1為Y1樣品稀釋液體積(mL),n1為Y1樣品稀釋倍數,m為原材料菇粉的質量(mg);c2為精制品Y2稀釋液濃度(mg/mL),V2為精制品Y2稀釋液體積(mL),m1為精制品Y2的質量(mg)。

1.2.3 單因素實驗 精確稱取(2.0±0.01) g多汁乳菇子實體粉末于錐形瓶,按液料比為30∶1 mL/g的比例加入水浸提溶劑,分別于40、50、60、70、80、90、100 ℃的磁力攪拌水浴鍋中恒溫浸提3 h,探究浸提溫度對多汁乳菇多糖得率的影響;同樣地,按液料比為30∶1 mL/g的比例加入水浸提溶劑,在90 ℃的磁力攪拌水浴鍋中分別恒溫浸提0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0 h,探究浸提時間對多汁乳菇多糖得率的影響;分別按液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g依次加入水浸提溶劑,在90 ℃的磁力攪拌水浴鍋中恒溫浸提3 h,探究液料比對多汁乳菇多糖得率的影響。所有實驗組別均按照1.2.1所述工藝進行。

1.2.4 響應面法實驗設計 依據1.2.3實驗結果,按表1進行三因素三水平的CCD中心組合實驗,包含了20組,所得數據通過式(3)進行曲面擬合[13-14]。

Y=k0+k1A+k2B+k3C+k4AB+k5AC+k6BC+k7A2+k8B2+k9C2

式(3)

其中,Y為響應值,k1～k9均為多項式系數,在實際響應面和等值線圖基礎上回歸分析確立,A、B、C為獨立變量的水平編碼值。

表1 多汁乳菇多糖提取CCD因素水平設計Table 1 Factors and levels in response surface designfor extraction of crude polysaccharides from wild Lactarius volemus

1.2.5 多汁乳菇粗多糖的抗氧化活性研究

式(4)

其中,A2為加入了焦棓酸與樣品的實驗組所得吸光值,A0只加入焦棓酸的對照組,A1僅加入了樣品的對照組,均以不加樣品不加焦棓酸的Tris-HCl作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～5000 μg/mL的多糖溶液和0～2000 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.5.2 ·OH清除活性的測定 在文獻[15]基礎上改進實驗條件,移取2 mL的9 mmol/L的FeSO4與2 mL的9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液混合,加入2 mL樣品溶液及2 mL 0.024%(w/w)H2O2溶液,室溫下放置3 min后于560 nm下測定各組吸光值,并計算其清除活性:

·OH清除活性(%)=100×[1-(B2-B1)/B0]

式(5)

其中,B2為加入了H2O2與樣品的實驗組所得吸光值,B1為僅加入了樣品的對照組,B0則為僅加入了H2O2的對照組,均以不加樣品不加H2O2的組別作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～500 μg/mL的多糖溶液和0～1000 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.5.3 DPPH自由基清除活性的測定 在文獻[15]基礎上改進實驗條件,移取2 mL的10 μmol/L DPPH·與2 mL樣品液混合,室溫黑暗條件下放置3 min,于517 nm下測定各組吸光值,并計算其清除活性:

DPPH自由基清除活性(%)=100×[1-(C2-C1)/C0]

式(6)

其中,C2為加入了DPPH·與樣品的實驗組所得吸光值,C0只加入DPPH·的對照組,C1僅加入了樣品的對照組,均以不加樣品不加DPPH·的H2O作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～20 μg/mL的多糖溶液和0～1000 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.5.4 ABTS自由基清除活性的測定 在文獻[16]基礎上改進實驗條件,配制7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L K2S2O8水溶液,等體積混合于黑暗條件下放置12 h,稀釋40～50倍使其在734 nm下的吸光值達0.700±0.002,即為ABTS+·液,移取此ABTS+·液2.4 mL與0.6 mL的樣品液混合,于室溫下放置1 min,于734 nm下測定各組吸光值,并計算其清除活性:

ABTS+自由基清除活性(%)=100×[1-(D2-D1)/D0]

式(7)

其中,D2為加入了ABTS+·與樣品的實驗組所得吸光值,D0只加入ABTS+·的對照組,D1僅加入了樣品的對照組,均以不加樣品不加ABTS+·的無水乙醇作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～20 μg/mL的多糖溶液和0～800 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.6 統計分析 實驗分析所用數據是三組平行實驗的均值±標準差,采用SPSS 17.0進行平行數據及組間數據之間的顯著性分析,并利用Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果分析

如圖1A所示,在40～100 ℃ 浸提溫度范圍內,多糖得率隨著溫度的升高而升高,可能原因是在此溫度范圍內作用多汁乳菇子實體粉末,升高溫度加快了真菌細胞質壁分離的速度,此時,液泡中的物質(包括多汁乳菇多糖)穿過細胞壁,擴散到外部溶劑水中的速度也隨之加快[17-18]。在80～100 ℃ 浸提溫度范圍內,多汁乳菇多糖得率達到2.12%～2.29%相對較高水平,表明浸提溫度是影響多汁乳菇多糖得率的關鍵因素之一。

圖1 浸提溫度(A)、浸提時間(B)、液料比(C)對多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature(A),time(B)and ratio of water to material(C)on yield of LVP

如圖1B所示,在0.5～5 h 浸提時間范圍內,多糖得率隨著時間的推移先升高后有所降低,可能原因是作用時間越長,對多汁乳菇子實體細胞壁的破壞越充分,促使了多糖的釋放,但超出一定的作用時間,多糖結構將受到一定程度的破壞而降低多糖得率[17-18]。在2～4 h浸提時間范圍內,多汁乳菇多糖產量達到2.06%～2.32%相對較高水平,表明浸提時間是影響多汁乳菇多糖得率的關鍵因素之一。

如圖1C所示,在10～50 mL/g液料比范圍內,隨著液料比的增大,多糖得率先升高至2.29%,后降低至1.68%,可能原因是,液料比增大促使多汁乳菇子實體粉末與提取溶劑的接觸面積增加,從而使得多糖在水中的溶解量增加,但當液料比超出一定范圍時,多汁乳菇多糖在水中的溶解量達到飽和狀態[17-18],從而導致多糖得率有所降低。在20～40 mL/g液料比范圍內,多汁乳菇多糖得率達到1.55%～2.29%相對較高水平,表明液料比是影響多汁乳菇多糖得率的關鍵因素之一。

2.2 響應面法設計對多汁乳菇多糖得率的影響

依據CCD模型,評判浸提溫度、浸提時間及料液比三因素對多糖得率的影響程度,結果如表2所示。多重回歸分析揭示了多糖得率響應值與實驗變量之間的關系,可通過如下的表達式進行描述:

Y(%)=2.24+0.043A+0.095B+0.098C-0.14AB+0.17AC+0.087BC-0.33A2-0.049B2-0.26C2

式(8)

其中,A、B、C分別取浸提溫度、浸提時間及液料比的編碼值。

表2 CCD實驗真實值與擬合方程預測值Table 2 Forecast values by fitting equation and real values of CCD experiments

式(8)中的三個變量參數對多糖得率影響的顯著性可通過表3中的F值和p進行表征,當F值絕對值越大時,p越小,兩組數據之間具有明顯的一致性。按p<0.05進行篩選,易知,對于多糖得率影響較大的有B、C、AB、AC、A2、C2。模型對應的顯著性水平遠小于0.01,說明此模型用于擬合分析A、B、C三因素對多糖得率的影響是具有顯著性的,即該模型是適宜的。該模型缺少的擬合值的顯著性為0.3307,遠遠大于0.05,這說明缺乏的擬合值并不重要。該模型對應的R2為0.9344,接近于1,表明此模型與真實數據之間具有良好的適用性。綜上可知,該回歸模型較好地定義了該系統中各因素與多糖得率之間的關系及任意兩個變量之間的相互聯系。圖2為三維響應曲面和等高線圖，如圖2a所示,當液料比處于0這個中間層次時,觀察浸提溫度和浸提時間之間形成的等高線圖,呈明顯的橢圓形狀,表明二者的交互作用對多糖得率有顯著性的影響(p<0.05),同樣的現象可在圖2b中觀察到，這表明浸提溫度和液料比的交互作用對多糖得率也有顯著的影響,與表2中的實驗結果一致。

通過建立這個CCD模型進行多糖得率的預測分析,得出多汁乳菇多糖最高得率預測值為2.32%,對應于如下條件:89.69 ℃的浸提溫度,4 h的浸提時間,33.42 mL/g 的液料比,根據實驗的可操作性,實際采用參數為:浸提溫度90 ℃,浸提時間4 h,液料比33∶1 mL/g,對應實際多糖得率為2.18%,與預測值無顯著性差異(p>0.05)。并采用I2-KI溶液、α-萘酚對所得多汁乳菇多糖提取物進行了淀粉及多糖驗證分析,結果顯示,多汁乳菇多糖提取物中不含有淀粉,確實含有多糖;分別采用凱氏定氮法、苯酚-硫酸法檢測所得提取物,顯示蛋白含量為11.37%,多糖純度為55.40%。

表3 CCD實驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of CCD experimental results

圖2 多糖提取因素實驗的CCD擬合響應曲面分析圖及等高線圖Fig.2 CCD fitting response surface and contour plots analysis for polysaccharide extraction factor experiments

2.3 多汁乳菇粗多糖的抗氧化活性

2.3.2 多汁乳菇多糖對·OH的清除活性 ·OH很容易穿過細胞膜,導致組織病理特征的出現和細胞死亡,因此清除·OH尤為重要。VC和多汁乳菇多糖清除·OH的活性在圖3B中給出,結果表明,·OH清除活性隨著多糖濃度的增加而增加,當多糖濃度為1000 μg/mL時,其清除活性高達95.56%,多汁乳菇多糖及VC對·OH清除活性的IC50值分別為:280.00、178.10 μg/mL,低于文獻[20]報道的新型冬蟲夏草多糖的IC50值0.76 mg/mL,表明多汁乳菇多糖具有良好的·OH清除活性。

2.3.3 多汁乳菇多糖對DPPH自由基的清除活性 DPPH自由基很容易接受抗氧化劑而被清除,是一種在517 nm下有最大吸收的穩定自由基,其被廣泛地應用于天然分子自由基清除活性的測定反應中。多汁乳菇多糖和VC分子清除DPPH自由基的活性見圖3C,結果表明,其清除活性也與樣品的濃度有關,且樣品的清除活性低于VC,當多糖濃度為1000 μg/mL時,其清除活性高達95.62%,多汁乳菇多糖及VC對DPPH清除活性的IC50值分別為:342.06、5.90 μg/mL,二者分別低于文獻[7]中的報道值665、18 μg/mL,表明多汁乳菇多糖具有良好的DPPH自由基清除活性。

2.3.4 多汁乳菇多糖對ABTS自由基的清除活性 VC和多汁乳菇多糖清除ABTS自由基活性如圖3D所示,在多糖濃度為100～800 μg/mL的范圍內,其清除活性與多糖的濃度呈正相關作用,且清除活性最高為98.89%,多汁乳菇多糖及VC對ABTS清除活性的IC50值分別為:167.65、10.57 μg/mL,稍低于文獻[20]報道的新型冬蟲夏草多糖的IC50值0.22 mg/mL,表明多汁乳菇多糖具有良好的ABTS自由基清除活性。

圖3 樣品對各種自由基的清除活性分析Fig.3 The scavenging activity of samples on four radicals

3 結論

本文對多汁乳菇多糖的提取條件進行了CCD優化處理,最終確立了其最優提取條件為:浸提溫度90 ℃,浸提時間4 h,液料比33∶1 mL/g。在最優提取條件下,多汁乳菇多糖得率達2.18%,與預測值一致,且稍高于文獻[7]報道值2.09%±0.03%,證明本文對多汁乳菇多糖的提取工藝采取的優化處理是有效的。

通過對多汁乳菇多糖粗品檢測驗證分析,證實此粗品確實含有多糖,且多糖純度為55.40%。

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Optimization of extraction process of polysaccharides from wildLactariusvolemusby response surface method and investigation of antioxidant activity

HUANG Juan1，HUANG Yan-yan1，LIU Dong-mei1，CHEN Su-qin2，PAN Wei-cai2

(1.Institute of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China；2.DaBaihui Company of Technology,Shenzhen 518081,China)

LactariusVolemus;polysaccharides;extraction;response surface design;antioxidant activity

2016-12-29

黃娟 (1991-)，女，碩士，研究方向：食品微生物利用與控制，E-mail:juanhuangscut@126.com。

*通訊作者:劉冬梅 (1972-)，女，博士，副教授，主要從事食品微生物利用與控制研究，E-mail:liudm@scut.edu.cn。

深圳市未來產業專項資金項目(CXZZ20140902155219302)；國家自然科學基金項目 (31101254)；廣東省科技計劃項目(2014A020208019)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)11-0055-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.002