冠心病患者血小板紫外光譜的變化

周 銘 唐海沁 符趙鑫 劉 銘

(安徽醫科大學第一附屬醫院老年心內科，安徽 合肥 230000)

·心、腦血管及代謝性疾病·

冠心病患者血小板紫外光譜的變化

周 銘 唐海沁 符趙鑫 劉 銘

(安徽醫科大學第一附屬醫院老年心內科，安徽 合肥 230000)

目的 觀察冠心病患者血小板紫外光譜的變化。方法 檢測對象分為冠心病組和對照組，冠心病組包括氯吡格雷組和阿司匹林組。提取血小板體外誘導聚集，采用紫外分光光度計進行掃描得到紫外光譜數據，應用Origin8.0及SPSS13.0軟件分析。結果 血小板紫外光譜在204 nm和280 nm波長處可見吸收峰，血小板聚集后在204 nm波長處吸收峰顯著大于聚集前；冠心病組與正常組以及冠心病組內氯吡格雷組和阿司匹林組血小板紫外光譜波峰出現位置差異無統計學意義(P>0.05)。結論 紫外光譜可用于臨床檢測血小板聚集，為其提供一種更為靈敏、準確的測定方法。

血小板聚集；紫外光譜；冠心病

在冠心病發生和發展中，血小板的活化和聚集是重要環節，不僅能夠作為診斷冠心病的佐證，也可以用來預測冠心病的風險度〔1〕。臨床上，抗血小板治療作為冠心病治療的基石，在一級和二級預防都起著至關重要的作用。目前血小板聚集的檢測方法由于體內血栓形成環境的復雜性只能粗糙和間接估計血小板聚集情況，不能充分反映血小板聚集的功能狀態〔2〕，尋求簡單、可行的反映血小板聚集程度的臨床檢測方法成為心血管研究內容之一。紫外光譜能夠在一定程度上反映有機化合物的分子結構，在醫學領域中應用廣泛〔3〕。本研究應用光譜學原理將紫外光譜檢測應用于老年冠心病患者血小板聚集的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇60歲以上住院服用抗血小板藥時間1 w以上的冠心病患者20例，男14例，女6例，平均年齡(78±7)歲，根據服用藥物分為氯吡格雷組和阿司匹林組各10例，藥物劑量為氯吡格雷75 mg/d或阿司匹林100 mg/d；同時選擇10例健康青年志愿者作為對照組，男6例，女4例，平均年齡(24±1)歲。

1.2 儀器與試劑 雙光束紫外可見光分光光度計(北京譜析通用儀器有限公司 TU1901)；比色皿(1 mm光程)；超聲波清洗器；離心機(Eppendorf Centrifuge 5415R)；10～1 000 μl加樣器(德國Eppendorf Research plus)，0.5～10 μl加樣器(Flnnplpeffe Y351084027)；真空采血管、EP管；二磷酸腺苷(ADP，美國Sigma公司A2754-100 mg)；花生四烯酸(AA，Sigma公司A9673-10 mg)；無水CaCl2(國產分析純)；生理鹽水。

1.3 實驗方法

1.3.1 血小板制備 真空采血管取兩組患者2 ml的1∶9檸檬酸鈉抗凝血作為樣本，用移液器將2 ml血移入EP管后放入離心機離心，采用Alhaloo法二次離心得到血小板沉淀，二次離心時的乏血小板血漿上清(PPP)留200 μl備用：取3 μl于比色皿，再將剩余的PPP與血小板沉淀混勻，然后各取混懸液3 μl于另兩個比色皿內。

1.3.2 血小板的誘導聚集 移液器吸取CaCl2及誘導劑加入含3 μl血小板懸液的比色皿內，其中氯吡格雷組加誘導劑ADP、阿司匹林組加AA誘導聚集，并使得最終濃度CaCl210 mmol/L，AA 0.7 mmol/L，ADP 10 μmol/L〔4〕。一份是混勻并充分反應后稀釋至4 ml；另一份則是待稀釋至4 ml后加入等量的誘導劑，比色皿內PPP血小板稀釋后加入CaCl2及誘導劑，反應時間控制在10 min內。正常組加入誘導劑ADP并作同樣的處理誘導聚集。

1.3.3 紫外光譜檢測 稀釋后的血小板充分混勻后放入紫外分光光度計，設置紫外光譜掃描范圍200～400 nm，掃描間隔為0.2 nm。基線采用同等量的CaCl2及誘導劑稀釋至4 ml校準，保證變量是加入的血小板并消除加入的誘導劑對紫外光譜的影響。檢測完后用超聲清洗比色皿，防止殘留物。實驗過程從釆血至上機檢測在3 h〔5〕內完成。UVWIN5.0軟件將紫外光譜檢測數據導出，采用Origin8.0軟件作圖。

1.4 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行t及χ2檢驗。

2 結 果

血小板在紫外區204 nm、280 nm處出現吸收峰，在加用誘導劑后，氯吡格雷組和阿司匹林組，血小板紫外光譜在204 nm波長吸光度顯著改變且聚集后吸光度峰值大于聚集前(P<0.05)，見表1。正常組波峰位置出現也在204 nm波長處，與冠心病組比較紫外光譜未見差異。冠心病組與對照組性別差異無統計學意義(P=0.69)。

表1 血小板紫外光譜204 nm波長處吸光值

3 討 論

血小板具有細胞膜系統和細胞骨架蛋白，特殊的儲存顆粒和線粒體、溶酶體等細胞器，而冠心病患者中，血小板的活化標志物CD62p、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅱa受體(PAC)-1等表達率明顯高于正常，平均體積和分布寬度也會顯著增高〔6〕，可以看出血小板反應紫外光譜是各種物質的綜合光譜。以往人單個血小板拉曼光譜的研究其振動峰主要顯示的是蛋白質和脂肪的混合峰，也有718 cm-1處磷脂分子C-N鍵938 cm-1處脂肪鏈C-C骨架的振動峰〔7〕。我們的結果表明血小板在204 nm和280 nm波長處具有紫外吸收峰，其位置反映的是分別是羧基和蛋白質中的共軛苯環體系，其中204 nm波長處血小板聚集前后的紫外光譜有著顯著變化。檢索相關文獻，發現血小板在近紅外光波長420 nm-1有吸收峰〔8〕，并隨著血小板濃度改變而變化，尚未發現紫外光譜應用于血小板研究的報道，本研究結果為臨床檢測血小板聚集程度提供新的參考方法，可依據聚集前后血小板特定波長處紫外吸收峰值的變化占聚集前吸光度的比值來反映血小板聚集率。

血小板在204 nm波長處的改變與血小板的聚集密切相關。在聚集過程中血小板活化膜糖蛋白(GP)會重新分布，膜GPⅡb/Ⅲa分子上的纖維蛋白原結合位點暴露，最終與纖維蛋白原的α鏈中的RGD肽序和γ鏈C端十二肽結合，通過信號轉導使相鄰的血小板聚集〔9〕。GP的產生和轉移以及GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原氨基酸殘基的結合等聚集過程中發生的反應，不僅有化合鍵的形成而且伴隨著氨基酸羧基的變化，引起聚集后反應羧基204 nm波長處吸收峰值增大。在重復的實驗中發現，當由于取樣誤差聚集后的血小板量略小于聚集前時(以280 nm處吸收峰值為標準)，仍可得這一結果。而且，實驗中充分稀釋的誘導劑與血小板混合幾乎不會引起血小板的聚集〔10〕，依此來模擬聚集前的血小板，確保其紫外光譜與聚集后具有可比性，同時也加入了乏血小板的比較，能對比觀察消除血漿成分對血小板光譜的影響，使實驗結果更為準確。目前，檢測血小板聚集功能，臨床上應用最為廣泛的是光比濁法，利用血小板聚集儀測定血小板聚集前后血漿透光率變化來間接反映血小板聚集率，但有不足：高脂血癥等其他影響血清透明度的因素會影響血小板吸光度；只能檢測較大的血小板聚集物，敏感性不高，因而比濁法不能夠準確反映血小板的聚集功能〔11〕。散射性粒子檢測法利用40 μm波長為675 nm的激光束透射到聚集顆粒發生反射，能夠很靈敏地檢測到血小板顆粒的大小及數量，但聚集顆粒不能全面反映凝血功能。血小板功能分析儀對纖維蛋白原缺陷性疾病診斷靈敏度低〔12〕，而剪切誘導法受溫度和血小板數目影響較大，電阻抗法因電極的放置則要求難以滿足臨床需要且靈敏度低，應用較少〔13〕。血栓彈力圖作為一種新型的床旁血小板聚集率檢測方法，運用血液凝固牽拉的原理，能夠直接使用全血檢測全面地分析血液凝固及溶解過程〔14〕，但檢測費用較高。紫外光譜檢測法有著很高的靈敏度，在無紫外吸收的溶劑中可達0.005%，實驗中也可以觀察到3 μl血小板血漿在204 nm處即有明顯吸收峰，而且多次實驗重復性高，因而能夠更準確地反映血小板的聚集功能〔15〕。本研究顯示紫外光譜主要揭示的是共軛體系等官能團間的關系，具有一定的局限性。實際上，氯吡格雷代謝產物與P2Y12受體會形成二硫鍵〔16〕，纖維蛋白原分子的α、β和γ鏈也是通過29對二硫鍵連接，阿司匹林會抑制AA環氧化酶使絲氨酸乙酰化〔17〕。紅外光譜利用分子振動能夠產生許多窄帶吸收，相比下能夠更多地反映官能團的種類及包含結構。Tablin等〔18〕發現了寒冷刺激的活化血小板膜-CH2區具有不同紅外吸收，而冠心病患者血小板也處于活化狀態，比較冠心病與正常人血小板紅外光譜-CH2區的振動變化，對于冠心病的診斷具有重要意義。

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〔2015-09-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

安徽省科技攻關項目(12010402116)

唐海沁(1956-)，男，碩士，主任醫師，博士生導師，主要從事冠心病血小板功能的研究。

周 銘(1989-)，男，碩士，主要從事冠心病血小板功能的研究。

R318.51

A

1005-9202(2017)11-2661-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.026