可視化分子探針的設計、合成及其對食品中氰化物的檢測

周彬彬，張繼紅，王芳斌，汪霞麗，戴 璇，楊 滔，郝遠強*

（1.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410117；2.商丘師范學院化學化工學院，河南 商丘 476000）

可視化分子探針的設計、合成及其對食品中氰化物的檢測

周彬彬1，張繼紅1，王芳斌1，汪霞麗1，戴 璇1，楊 滔1，郝遠強2,*

（1.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410117；2.商丘師范學院化學化工學院，河南 商丘 476000）

以萘酰亞胺偶氮苯為檢測信號基團，以水楊醛為氰根離子的識別基團，通過將萘酰亞胺重氮鹽和水楊醛單元偶聯，得到基于萘酰亞胺的偶氮苯染料分子探針。研究發現，探針溶液與氰化物反應后，紫外光譜吸收峰從波長404 nm轉移至505 nm，顏色從黃色變為紅色。在水溶液體系中，探針分子能實現對氰化物的比值式檢測，線性范圍為0.5～40.0 μmol/L，檢出限為0.13 μmol/L，遠低于世界衛生組織規定飲用水中的氰化物最大含量（1.9 μmol/L）。且該探針分子具有很強的特異性，對CN－的檢測不受F－、Cl－、Br－、I－、SCN－、AcO－、S2－、H2PO4－、N3－、NO3－等共存陰離子的影響。在對實際食物樣品中氰化物進行檢測時，該方法的準確度與國標方法一致。另外，利用探針分子制備了氰化物的檢測試紙，可直接目測出含氰化物濃度大于5.0 μmol/L的樣品溶液。

氰化物；食品；試紙；比色探針；檢測

民以食為天，食品安全是關注度極高的公共衛生問題，近年出現的鎘大米、染色饅頭、三聚氰胺、瘦肉精等食品安全事件觸目驚心，影響了人民群眾的生活和身體健康。氰化物是一種能嚴重危害食品安全的劇毒物質，能通過與細胞線粒體內的高鐵細胞色素氧化酶相結合，生成氰化高鐵細胞色素氧化酶，從而使其失去傳遞氧的作用，造成人體組織缺氧窒息，進而引起組織衰竭甚至機體死亡[1]。有研究表明：口服氰化鉀、氰化鈉的致死量僅為1～2 mg/kg，口服氫氰酸的致死量為0.7～3.5 mg/kg[2]。因此，食品中氰化物的檢測是食品質量安全控制的一項重要的檢測指標，也是一項常規理化檢測指標。

然而，現行國家標準規定的食品中氰化物檢測方法前處理過程較復雜，實際檢測過程中對樣品的處理過程易對檢測結果產生較大影響，且檢測過程中使用的部分樣品有較大毒性[3-6]。近幾年，隨著科學技術的發展，一些新的檢測技術在食品安全檢測方面展現了廣泛的應用前景，研究者們大量研究了光譜法、色譜法、電化學法、熒光探針法、離子色譜-脈沖安培檢測法、硝酸銀滴定法及快速檢測試紙條法等在氰化物檢測方面的應用[7-12]。這些新型技術因各自的優勢為氰化物檢測技術的進步做出了貢獻，但也分別因靈敏度不夠高、儀器價格貴、易受干擾、操作復雜等各種原因而未廣泛推廣。而現有的氰化物檢測試紙條雖具備現場快速定性的優點，但其靈敏度目前還不能達到世界衛生組織規定的飲用水中氰化物含量的檢測濃度，且其易受食品中復雜成分的干擾，難準確應用于食品中氰化物的檢測[8,13]。

比色法因其不需要借助復雜的儀器、可通過簡單的紫外分析儀或直接用肉眼對顏色的顯著變化進行分析做出快速的判斷而成為了被廣泛研究和應用的檢測分析方法，在食品中污染物的檢測方面也廣受青睞[14-16]。偶氮苯類分子因苯環上擁有多個功能化修飾的位點、在可見光譜區內有較強吸收的優勢，常被應用于比色法探針的設計，最近，研究者們還報道了偶氮苯類分子被用于氰化物檢測探針分子設計的研究[17-18]。近年來的研究表明，萘酰亞胺偶氮苯作為偶氮苯類分子中的一員，其吸收光譜受苯環對位取代基的性質影響很大[19-20]，而理想的比色法探針需要對目標分子有特異性響應并伴隨顯著的光譜變化，這說明在萘酰亞胺偶氮苯分子對位上連接特殊識別基團后，非常適合于比色法分子探針的設計。另外，目前氰化物檢測的分析手段中，親核加成的機理因利用了氰根離子特殊的親核性而廣受研究者關注[21-23]。在基于親核加成機理而設計的對其他各種陰離子進行分析檢測的探針分子中，水楊醛被當作是常見的有效識別基團[24]。近年的研究中，水楊醛單元還被應用于氰化物快速響應探針分子的構建[25-26]。因此，本研究通過偶氮鍵將水楊醛（識別基團）與萘酰胺骨架（信號基團）連接起來得到氰化物分子探針，利用水楊醛與CN－的親核加成作用對樣品中的氰化物進行識別，然后通過結合CN－后萘酰胺重氮苯骨架上較強的分子內電荷的轉移效應而產生的吸收光譜紅移以及顏色的顯著變化對食品中氰化物實現高效檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二甲基亞砜（色譜純）、4-溴-1,8-萘酐（分析純）、四丁基氰化胺（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；正丁胺、鈀碳、亞硝酸鈉、疊氮化鈉、水楊醛、乙酸鈉、硫酸（均為分析純） 安耐吉化學公司；乙酸、甲醇、二氯甲烷、氯仿等有機溶劑（均為色譜純）天津大茂化學試劑廠；4-氨基丁酸（分析純） 吉爾生化上海有限公司；作為干擾性實驗的四丁基銨鹽類陰離子（均為分析純） 薩恩化學技術（上海）有限公司；實驗中所有溶液配制用水均為超純水（電導率18 MΩ/cm）美國密理博公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；AMX-500核磁共振譜儀 瑞士布魯克公司；MAT95XP高分辨質譜儀 美國菲尼根公司；Simplicity Plus 185純水儀 美國密理博公司；移液槍 德國艾本德公司；DZG26050真空干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 探針分子合成

圖1 探針分子的合成路線Fig.1 Synthetic route of colorimetric probe

根據文獻方法及實驗室之前的研究工作[27-29]（探針分子合成路線如圖1所示），將4 g化合物（1）4-溴-1,8-萘酐（14.5 mmol）與4-氨基丁酸（1.6 g，17 mmol）溶于100 mL乙醇中，加熱回流過夜。減壓蒸餾得初產物，以V（二氯甲烷）∶V（石油醚）=2∶1過硅膠柱，得化合物（2）。取2 g（5.5 mmol）化合物（2）于30 mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后向反應體系中加入1 mL含0.78 g（12 mmol）的疊氮化鈉溶液，于100 ℃反應10 h后，將反應液倒入100 mL冰水里，過濾去沉淀，用二氯甲烷提純得化合物（3）。將1 g化合物（3）溶于80 mL二氯甲烷，加入0.15 g鈀/碳催化劑并通入氫氣，常溫反應6 h，過濾取濾液，旋轉蒸發后得橘黃色固體。將1.5 mL濃硫酸與100 mg亞硝酸鈉加入反應瓶，冰浴攪拌15 min，再加熱至60 ℃，攪拌至固體全部溶解后，將反應體系置于冰浴，在30 min內將0.3 g上述化合物緩慢加入以上反應液，之后加入1 mL乙酸，冰浴條件下反應4 h即得化合物（4）；將0.14 g（1.1 mmol）水楊醛溶于100 mL甲醇，再將水楊醛溶液緩慢滴加至上述反應液，以飽和醋酸鈉溶液調節溶液pH 5左右，常溫反應3 h。沉淀物經熱水洗后，晾干，以二氯甲烷作為洗脫劑過硅膠柱，得目標產物210 mg，產率為48.7%。核磁共振氫譜（400 Hz，CDCl3）δ 11.42（s，1H），δ 10.26（s，1H），δ 9.45（dd，J = 8.5，1.0 Hz，1H），δ 9.11（d，J = 7.9 Hz，1H），δ 8.87（t，J = 7.9 Hz，1H），δ 8.42（d，J = 2.3 Hz，1H），δ 8.37（dd，J = 7.8，2.4 Hz，1H），δ 8.05（d，J = 8.0 Hz，1H），δ 7.95（dd，J = 8.4，7.4 Hz，1H），δ 7.07（t，J = 8.0 Hz，1H），δ 4.08（t，J = 7.9 Hz，2H），δ 2.24（t，J = 7.3 Hz，2H），δ 1.83～1.72（m，2H）。高分辨率質譜測試結果m/z 430.102 7為分子離子峰[M－H]－，與理論計算值m/z 430.103 9能很好地吻合。

1.3.2 核磁共振檢測

樣品準備：將5 mg純化目標產物置于核磁管中加入CDCl3（0.55 mL，含0.1%四甲基硅烷）超聲5 min溶解。核磁測試條件：掃場范圍定為1H：δ －2～13，掃描次數：16 次，探頭溫度為室溫。

1.3.3 紫外檢測

紫外檢測在常溫條件下進行，掃描范圍為300～700 nm，檢測體系中，探針分子的濃度為30 μmol/L，體系總體積為2 mL。檢測過程中的CN－和其他干擾實驗的陰離子（F－、Cl－、Br－、I－、SCN－、AcO－、S2－、H2PO4－、N3－、NO3－）均為四丁基銨鹽的形式。

1.3.4 食品中氰化物的檢測

直接用移液槍移取50 μL酒、500 μL水等食物樣品加入至探針溶液中，調整溶液體積至2 mL、探針分子溶液濃度為30 μmol/L，檢測紫外光譜的變化情況。之后向探針溶液中加入不同濃度的CN－、標準溶液，檢測其光譜變化情況，制作標準曲線，計算樣品中氰化含量。同時，參考GB/T 5009.36—2003《糧食衛生標準的分析方法》中檢測試劑的配制方法和GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》以及GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛生標準的分析方法》中氰化物的檢測方法，對樣品進行檢測，并將國標方法測得的結果與本研究采用的探針方法所測得的檢測結果進行比較。

1.3.5 氰化物檢測試紙的制備

將探針分子溶解于三氯甲烷中，濃度為0.05 mol/L，再將濾紙直接置于溶液中浸泡1 h，然后取出晾干即可得到檢測用試紙。

2 結果與分析

2.1 探針分子的合成與表征

設計的探針分子以萘酰胺為信號基團，水楊醛為氰化物的識別基團，兩者通過偶氮鍵相連，合成得到對氰化物具有高選擇性和高靈敏度的比色檢測探針分子（合成路線如圖1所示，探針分子的合成過程詳見1.3.1節的合成方法）。萘酰亞胺偶氮苯對位上4-氨基丁酸的引入，旨在提高探針分子的水溶性，使其能于水溶液體系中完成對氰化物的檢測，同時羧基的引入能提高探針分子在試紙上的著附率，為氰化物檢測試紙的制備提供便利。合成的探針分子通過高分辨率質譜進行了表征，結果顯示m/z 430.102 7為分子離子峰[M－H]－，與理論計算值m/z 430.103 9完全吻合。進一步的核磁表征也對合成產物進行了證實（圖2），所有的氫的化學位移都找到了對應的歸屬。質譜和核磁的表征結果說明，通過以上所述合成路線及合成方法順利得到了目標探針分子。

圖2 探針分子核磁表征結果Fig.2 Proton NMR spectrum of the probe

2.2 探針分子對氰化物的檢測機理

圖3 探針分子檢測氰化物的原理示意圖Fig.3 Detection mechanism of the probe toward cyanide

如圖3所示，探針分子中的水楊醛部分的羰基與羥基會形成分子內氫鍵，從而使得該羰基的反應活性增加，易被CN－親核進攻而得到加成的中間體，CN－加成的中間體上酚羥基的氫再迅速出現分子內的質子轉移，進而得到了偶氮鍵對位為氧負離子的探針分子和CN－的加合物[30]。在加合產物中，水楊醛部分新生成的酚氧負離子是強的給電子基團，而在另一側的萘酰亞胺部分上的酰亞胺則為強的拉電子基團，從而在探針分子和CN－的加合物內即產生了較強的分子內電荷轉移效應，直接導致探針分子溶液的紫外吸收光譜顯著紅移，紅移的范圍超過100 nm，同時，在整個CN－親核加成該探針分子的反應過程中，伴隨著反應液從黃色變為紅色的明顯顏色變化。

2.3 探針分子定量檢測氰化物

探針分子檢測體系設定為30 μmol/L的探針分子于水溶液體系中，在該體系下，探針分子能對氰化物迅速產生響應。如圖4所示，隨著加入氰化物濃度的增加，探針分子在404 nm波長處的特征吸收峰逐漸下降，相應在505 nm波長處出現了一個新的吸收峰，且峰值隨氰化物濃度的增加而增大，當氰化物濃度達到60 μmol/L（即2 倍于探針分子濃度時），新產生的505 nm波長處的吸收峰達到最大值，繼續加入更大濃度的氰化物溶液，探針溶液的紫外光譜也不再發生變化。

圖4 探針分子在不同濃度氰化物作用下的紫外吸收光譜（A）和不同濃度氰化物溶液下探針分子在處紫外光譜強度（B）的變化Fig.4 UV-vis spectra of the probe (30 μmol/L) with cyanide and changes in absorption intensity of the probe in the presence of different concentrations of CN－

本研究利用探針分子在不同濃度氰化物加入后，在505 nm和404 nm波長處紫外吸收光譜的顯著規律性變化來對氰化物進行檢測，以505 nm和404 nm波長處的吸收光譜比值，即A505nm/A404nm與氰化物濃度的關系來對氰化物實現定量分析。隨著氰化物濃度的增加，A505nm/ A404nm比值的增大呈現良好的線性上升的趨勢，其線性方程為A = 0.040 48×C（CN－）+0.065 75，R2=0.997，線性檢測范圍為0.5～40.0 μmol/L，檢出限為0.13 μmol/L。該數值低于世界衛生組織規定的飲水中CN－含量的上限值（1.9 μmol/L），以及GB 2757—2012《蒸餾酒及其配制酒》和GB/T 5009.36—2003《糧食衛生標準的分析方法》中規定的氰化物在蒸餾酒與配制酒中的限量值為8.0 mg/L（以HCN計，折算酒精度為100%），糧食中氰化物限量值為0.015 mg/kg（約合0.58 μmol/L）的限量值，說明該法的靈敏度足以滿足食品中氰化物的檢測。另外，如探針分子對氰化物的檢測機理探討部分所述，隨著氰化物加入后，探針分子吸收光譜的顯著變化引起了探針溶液顏色的明顯變化，溶液由單獨探針時的黃色變為加入氰化物后的紅色（圖5）。因此，該檢測體系可對氰化物實現裸眼檢測。

圖5 探針分子在不同濃度氰化物存在下溶液顏色變化Fig.5 Photographic images of the probe with different concentrations of cyanide

2.4 探針分子對CN－的選擇性

在水溶劑體系中，將探針分子的濃度設定為30 μmol/L，加入CN－及其他干擾性陰離子濃度都為60 μmol/L。該體系下探針分子能對CN－產生迅速的響應，CN－與探針分子的反應在幾秒鐘內即可完成。探針分子與CN－作用后，在505 nm波長處會出現新的吸收峰，而原來在404 nm波長處的吸收峰會明顯下降，從而探針分子的紫外吸收比值A505nm/A404nm顯著增大，而與其他相關陰離子作用后，則不能引起探針分子的紫外吸收比值A505nm/ A404nm的顯著變化（圖6A）。同時，探針分子與CN-的反應伴隨著溶液顏色從黃色變為紅色的顯著變化。然而，相同條件下，加入等濃度的其他陰離子（F－、Cl－、Br－、I－、SCN－、AcO－、S2－、H2PO4－、N3－、NO3－），都沒有引起檢測溶液光譜性質的明顯變化，檢測溶液的顏色也都保持為黃色（圖6B）。另外，進一步的競爭實驗也證實，即使在上述陰離子的存在下，探針分子對CN－的檢測能力也不會受到明顯影響，原因可能是上述陰離子不具備CN－對探針分子水楊醛部分強的親核加成能力，實驗結果表明該探針分子對CN－的檢測具有很好的選擇性。

圖6 探針分子對不同陰離子的響應（A）及加入不同陰離子探針分子相應的顏色變化（B）BFig.6 UV-vis spectral responses of the probe upon the addition of various anions in aqueous solution and photographic images of the probe upon the addition of various anions

2.5 實際樣品的檢測結果

以上研究證實了本研究中設計的探針分子對氰化物的檢測具有較高的靈敏度和選擇性，但實際的食物樣品檢測過程中，因樣品成分復雜，具有一定的特殊性。因此，為了進一步考察該實驗方法的實用性，本研究選取了白酒、配制酒、水等較易出現氰化物含量超標的食物樣品作為代表，將該法與國標方法的檢測結果進行對比研究，以確定該方法的準確性。如表1所示，該方法的檢測結果與國標方法的檢測結果基本一致，結果的偏離值都在5%的范圍之內，且該方法在對白酒、配制酒、水等實際樣品的檢測過程中，表現出了較高的穩定性，3 次獨立檢測結果的相對標準偏差均不大于6.8%。上述結果表明該方法對實際食物樣品中氰化物的檢測具有較高的可行性。

表1 探針分子對實際樣品的檢測Table1 Detection of cyanide in real samples

2.6 氰化物檢測試紙實驗結果

試紙檢測法因具備便捷、快速等特點，在檢驗檢測領域具有很強的實用性。食品安全檢驗檢測領域時效性要求高，快速檢測方法的開發尤為重要，因此，各類食品污染物中檢測試紙的開發是廣大食品安全檢驗研究領域研究者們關注的焦點。本研究中設計的探針分子在與氰化物作用之后，顏色發生了極為明顯的變化，為氰化物檢測試紙的制備提供了基礎。為了進一步拓展該探針分子的潛在應用價值，研究過程中利用濾紙制備了基于探針分子的氰化物檢測試紙。制作過程為：將探針分子溶解于三氯甲烷中，溶液濃度控制為0.05 mol/L，將準備好的濾紙條直接置于探針溶液中浸泡1 h，然后取出濾紙條晾干即可得到檢測試紙。對氰化物進行檢測時，將制得的試紙浸入含不同濃度氰化物溶液中，稍后觀察試紙的顏色變化即可。如圖7所示，不同濃度的氰化物導致了試紙不同的顏色變化，隨著氰化物溶液濃度的逐漸增大，檢測試紙的顏色逐漸加深，從最初試紙的本色（黃色）變為了氰化物濃度為100 μmol/L后的深紅色，氰化物濃度繼續增大，試紙的顏色也不再發生變化。且研究發現，采用該探針分子制備的氰化物檢測試紙通過肉眼可直接觀察到的最低氰化物檢測濃度可達到5.0 μmol/L。

圖7 檢測試紙在不同濃度氰化物作用下的顏色變化Fig.7 Photographic images of test strips for various concentrations of cyanide

3 結 論

本研究以水楊醛為識別基團，通過偶氮鍵與信號基團萘酰亞胺偶氮苯偶聯，合成了一種基于萘酰亞胺偶氮苯染料的新型氰化物比值式比色法探針。利用水楊醛與CN－的親核加成作用對樣品中的氰化物進行識別，然后通過結合CN－后萘酰亞胺重氮苯骨架上較強的分子內電荷轉移效應而產生吸收光譜紅移以及顏色的顯著變化對食品中氰化物實現高效檢測。研究發現，在水溶液體系中，探針溶液與氰化物反應后，紫外光譜吸收峰及溶液顏色發生了顯著變化；探針分子對氰化物的檢測具有很強的特異性和較高的靈敏度。同時，制備得到了基于探針分子的氰化物檢測試紙，可目測出濃度大于5 μmol/L的氰化物溶液。在對實際食物樣品中氰化物進行定量檢測時，該比值式檢測方法的準確度與國標方法一致。且該法與目前常用的食品中氰化物檢測方法相比，具有簡單、快捷、低毒等優勢，因此，該探針分子在食品中氰化物的快速檢測方面具有較大的潛在應用價值。

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Design, Synthesis and Application of Colorimetric Probe for Cyanide Detection in Food

ZHOU Binbin1, ZHANG Jihong1, WANG Fangbin1, WANG Xiali1, DAI Xuan1, YANG Tao1, HAO Yuanqiang2,*
(1. Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Changsha 410117, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

In this study, a colorimetric probe was devised and synthesized by coupling a salicylaldehyde moiety, which acts as a recognition unit, to the naphthalimido diazonium salt (a signal unit) through an azo bond for the detection of cyanide. After reacting with cyanide, the absorption bands of the probe shifted from 404 to 505 nm and the color changed rapidly from yellow to red. The probe allowed ratiometric detection of cyanide in aqueous solution with a linear range of 0.5-40.0 μmol/L and a limit of detection (LOD) of 0.13 μmol/L, which is much lower than the maximum contaminant level (1.9 μmol/L) for cyanide in drinking water set by the World Health Organization. The probe also displayed excellent selectivity for CN-rather than other anions including F-, Cl-, Br-, I-, SCN-, AcO-, S2-, H2PO4-, N3-and NO3-. The method developed in this study gave the same results as those from the national standard method in real sample detection. In addition, the probe was successfully used to prepare test strips, which can be used to monitor cyanide conveniently, and the discernible concentration of cyanide can be as low as 5.0 μmol/L.

cyanide; food; test strip; colorimetric probe; detection

10.7506/spkx1002-6630-201712047

O657.32

A

1002-6630（2017）12-0304-06

周彬彬, 張繼紅, 王芳斌, 等. 可視化分子探針的設計、合成及其對食品中氰化物的檢測[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 304-309.

10.7506/spkx1002-6630-201712047. http：//www.spkx.net.cn

ZHOU Binbin, ZHANG Jihong, WANG Fangbin, et al. Design, synthesis and application of colorimetric probe for cyanide detection in food[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 304-309. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712047. http：//www.spkx.net.cn

2016-08-04

湖南省食品藥品監督管理局食品藥品安全科技項目（湘食藥科R201516）；國家自然科學基金聯合基金項目（U1404215）

周彬彬（1984—），男，工程師，博士，研究方向為食品質量管理與食品安全檢測。E-mail：229480750@qq.com

*通信作者：郝遠強（1985—），男，講師，博士，研究方向為環境與食品分析檢測。E-mail：hao0736@163.com