基于間接競爭法的表面等離子共振免疫傳感技術檢測雌二醇

賈映彤，彭 媛，白家磊，張希浩，寧保安，高志賢,*，崔建升*

（1.河北科技大學環境科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津 300050）

基于間接競爭法的表面等離子共振免疫傳感技術檢測雌二醇

賈映彤1,2，彭 媛2，白家磊2，張希浩2，寧保安2，高志賢2,*，崔建升1,*

（1.河北科技大學環境科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室，天津 300050）

建立一種基于間接競爭法的表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）免疫傳感技術檢測雌二醇（estradiol，E2），這種方法無需標記，可以實時監測競爭過程。在間接競爭實驗中，E2和E2的單克隆抗體（monoclonal antibody，E2-mAb）等體積混合后共同競爭被固定在了SPR傳感器的芯片表面的E2-牛血清白蛋白包被原（E2-bovine serum albumin，E2-BSA），SPR產生的信號和E2的質量濃度呈反比。優化實驗參數如抗體質量濃度、再生次數等，最后再用全脂牛奶做E2的加標實驗。實驗的線性范圍為15.63～500 ng/mL，最低檢出限為11.13 ng/mL。本研究的SPR免疫傳感技術構建了一種通用的方法，可以用來無標記檢測其他不同的小分子。

表面等離子共振；無標記；雌二醇；實時；間接競爭

雌二醇（estradiol，E2）屬于環境內分泌干擾物[1]，是一種自然產生的雌激素[2]。現今越來越多的養殖場在飼料中會加入過量的E2作為生長促進劑來促進動物食欲、增加動物體重、使蛋白轉化率提高來增加瘦肉比率從而提高產率[3]。但是過量的E2會通過食物鏈富集在如牛奶、雞肉等動物性農產品中，對人體造成嚴重的危害。E2會使男性的生殖系統發育和功能異常，精子數量和質量下降[4]，嚴重時甚至引發尿道下裂、性腺萎縮和睪丸癌等疾病[5]。研究表明，長期暴露在雌激素下的職業男性患陽痿的幾率會大大增加[6]。而外源性的E2也會引起女性的月經不調、卵巢萎縮等疾病，引起流產甚至不孕、子宮內膜異位，卵巢癌等疾病，女性組子宮肌瘤、宮頸癌等疾病也被證實與E2有關[7]。E2的殘留還會使女性兒童提前發育，男性兒童乳腺發育呈女性化的趨勢[8]，由于嬰幼兒身體的組織和器官血液分布尚未建立用來阻止或減緩外部污染物的屏障[9]，所以E2對嬰幼兒和青少年兒童比成人的毒性更大。因此，考慮到食品安全問題，需要有效的檢測技術來檢測E2。

目前針對食品中的E2的檢測方法眾多，主要包括如化學發光[10]、氣相色譜法[11]、氣相色譜-質譜法[12]，高效液相色譜[13]、液相色譜-質譜聯用法[6]，然而這些方法需要繁瑣的程序和復雜的預處理過程[143]，所以不適合快速和實時檢測食品中的E2殘留。最近十幾年，不同的生物方法被用于檢測E2，如酶聯免疫分析[15]、電化學傳感器[16]、酶熱傳感器[17]和表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器等[18]。

現在SPR傳感器由于其無需標記、可以實時快速動態檢測的優點[19]已經成為了最有希望用于生物痕量檢測的技術之一[20]。當傳感器芯片表面和分析物發生反應時，SPR傳感器可以精確檢測到折射率的變化[21]，SPR傳感技術已經得到了深入的研究和廣泛的應用。SPR傳感器研究對象最初主要是病毒、蛋白質、DNA、抗體、抗原、藥物、細胞、多肽、RNA類脂等物質，而隨著科學技術的進步，SPR傳感技術在環境監測[22]、食品安全[23]、遺傳分析[24]等領域得到了廣泛的應用。

本實驗基于間接競爭法利用SPR免疫傳感技術定量檢測E2，將完全抗原固定在芯片表面之后注入靶標小分子與一定質量濃度抗體的混合液，使表面固定的完全抗原和溶液中的被測分析物競爭結合溶液中抗體，所以當溶液中被測分析物質量濃度減少時，芯片表面抗原結合的抗體就變多，SPR的響應信號就大，即SPR傳感器的信號變化與被測物的質量濃度呈反比。實驗優化了E2-mAb、E2-BSA質量濃度、再生次數、再生液等條件，以牛奶為試劑樣品做了加標回收實驗，擬建立一種基于間接競爭法的SPR免疫傳感技術檢測E2的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶 天津市購。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、吐溫20、乙醇胺等試劑均為國產分析純；E2、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 百靈威科技有限公司；E2-BSA、E2-mAb由實驗室自制[25]。

E2-mAb用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，pH 7.4，用前超聲脫氣）溶解；E2-BSA溶解于0.01 mol/L的醋酸鹽緩沖液（NaAc-HAc，pH 4.5）中；E2溶解于含5%甲醇的PBS中；封閉液為1 mol/L，pH 8.5的乙醇胺溶液。

1.2 儀器與設備

Autolab ESPRIT SPR傳感器 荷蘭Eco Chemie B.V.公司；AL-204分析天平 美國Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 E2包被原的固定及其穩定性分析

將SPR芯片（表面鍍有金膜）用預先配制的Pirahha洗液（V（H2SO4）∶V（H2O）=7∶3）浸泡1～2 h以除去所有的有機物質，使金芯片羥基化[26]，取出洗凈，氮氣吹干。將潔凈的SPR芯片浸入1 mmol/L 11-巰基十一烷（11-mercaptoundecanoic acid，MUA）溶液中，室溫過夜，使芯片上自組裝上羧基，取出后用去離子水和無水乙醇交替沖洗，氮氣吹干。

將SPR芯片裝入傳感器中，以pH 4.5的醋酸鹽緩沖溶液做為偶合緩沖溶液，在反應池中依次加入0.4 mol/L的EDC和0.1 mol/L的NHS溶液來活化芯片表面的羧基，用來進行抗原的固定。之后用偶合溶液配制一定質量濃度的E2-BSA，以pH 8.5的乙醇胺為封閉液，0.05 mol/L的NaOH溶液為再生溶液，緩沖溶液作參比。將這些溶液加入樣品池進行固定化程序。

E2-BSA固定好后，每天檢測同一質量濃度的E2抗體（14.22 μg/mL），考察E2-BSA的穩定性。

1.3.2 間接競爭實驗

檢測流程如圖1所示。將一定質量濃度的抗體，與不同質量濃度的E2標準液等體積混合后室溫孵育加入樣品池中（混合后E2終質量濃度分別為3.91、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 ng/mL）使E2和E2-BSA共同競爭E2-mAb，然后分別測定SPR響應值。在循環測試后會用再生液將和E2-BSA結合的E2-mAb洗掉從而對芯片進行再生。為保證檢測結果的重復性，每次實驗均測量3 次。

圖1 間接競爭法的檢測流程Fig.1 Schematic diagram of estradiol detection, including E2-BSA immobilization, E2and E2-BSA competition for E2-mAb and regeneration

1.3.3 特異性實驗

選擇E2的結構和功能類似物：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚、雌酮和雌三醇。將這些物質分別配制成不同質量濃度梯度的標準溶液，用間接競爭法進行檢測，考察該方法的特異性。

1.3.4 牛奶樣品的處理

奶樣中每100 mL含蛋白質3.0 g、脂肪3.5 g、碳水化合物5.0 g、鈉50 mg。1 mL不同質量濃度的E2標準液分別加入1 mL的牛奶樣品中，然后加入等體積的乙酸乙酯到牛奶樣品，因為相似相溶原理從而將其中的E2萃取出來。輕輕振蕩靜置至分層，取上層乙酸乙酯并用氮氣吹干，最后用1 mL含5%甲醇的PBS定容。

2 結果與分析

2.1 E2-BSA的固定質量濃度的優化

圖2 不同質量濃度的E2-BSA產生的SSPPRR信號Fig.2 SPR signal response to different E2-BSA concentrations

不同質量濃度的E2-BSA與SPR信號變化關系如圖2所示，可以看出隨著E2-BSA質量濃度的增加，傳感信號變化增大，這說明E2-BSA在芯片表面的固定量逐漸增大，在1.0 mg/mL處固定量幾乎接近飽和，所以選擇1.0 mg/mL為E2-BSA的最佳固定質量濃度。

由于E2-BSA固定在SPR的芯片表面之后，不可能再將其取出保存到4 ℃中，只能加入PBS密封保存，所以有必要考察E2-BSA在該保存條件下的穩定性。在SPR芯片表面固定優化好的質量濃度即1 mg/mL的E2-BSA，然后每天測定混合后質量濃度為7.11 μg/mL抗體產生的SPR響應。將第1次檢測到的SPR信號記為R0，以后每天檢測到的SPR信號記為R，以R/R0為縱坐標，作為對穩定性的參考，結果如圖3所示。從圖3可以看出，第5天時仍能產生75%以上的響應，第7天才降至50%以下，表明直接固定在芯片上的E2-BSA穩定性良好。

圖 33 EE2-BSA的穩定性Fig.3 Study of antigen stability

2.2 最佳抗體質量濃度的選擇

將一系列質量濃度梯度稀釋的E2-mAb分別加入樣品池，使抗體和E2-BSA特異性結合，之后用PBS沖掉非特異性吸附，以PBS為參比溶液，觀察SPR信號，最終確定最佳使用質量濃度。

間接競爭反應中抗體用量應遵從的原則：為使待測液中的E2小分子與芯片表面固定的E2-BSA能夠有效地與E2-mAb競爭，所用抗體的量需要接近其和芯片表面抗原特異性結合時達到飽和時的用量[27]。用不同的抗體質量濃度和對應的SPR信號變化如圖4所示，可以看出混合后最終質量濃度為7.11 μg/mL的E2-mAb就可以產生足夠的SPR響應信號，曲線也進入平臺期，說明芯片表面結合的抗體趨于飽和，所以選擇7.11 μg/mL的抗體作為最佳質量濃度抗體進行下一步實驗。

圖4 不同質量濃度抗體產生的SPR信號Fig.4 SPR signal with different concentrations of E2-mAb

2.3 再生條件的優化

分別用0.1 mol/L鹽酸溶液、0.1 mol/L鹽酸+0.1% SDS溶液、0.1 mol/L鹽酸+0.1% TritonX-100、0.05 mol/ L NaOH溶液進行再生，每次再生時為120 s。

通過實驗發現，0.05 mol/L NaOH溶液可以去除99.70%的結合抗體。0.1 mol/L鹽酸+0.1% SDS溶液可以去除97.03%的結合抗體，而0.1 mol/L鹽酸+ 0.1% Triton X-100可以去除98.57%的結合抗體，0.1 mol/L鹽酸溶液能去除94.10%的結合抗體。所以選擇0.05 mol/L NaOH溶液作為再生液。

同時研究再生次數對金膜表面的E2-BSA活性的影響。檢測同一最終質量濃度為7.11 μg/mL的抗體，以0.05 mol/L NaOH溶液為再生液。由圖5可以看出，經過38 次的再生，抗體產生的信號同第一次的信號比較依然在75%以上，表明固定在SPR芯片上的抗原在多次再生之后依然可以保持良好的活性，重復性良好。

圖5 再生次數對E2-BSA穩定性的影響Fig.5 Influence of number of regenerations on the stability of E2-BSA

2.4 間接競爭實驗結果

E2-BSA固定化質量濃度為1.0 mg/mL，將14.22 μg/mL的抗體，與一系列質量濃度梯度的E2標準液（3.1～1 000 ng/mL）等體積混合，進行間接競爭實驗，監測曲線如圖6所示，包括基線、競爭、洗去非特異性吸附和再生。

圖6 SPR間接競爭實時監測曲線Fig.6 Real-time monitoring curve of indirect competition

間接競爭結果如圖7a所示，可以看出隨著E2質量濃度的增加，SPR傳感信號顯著降低，競爭明顯。以E2小分子質量濃度為0時的SPR響應值為R0，一定質量濃度E2的響應值為R，抑制率/%＝（R0－R）/R0×100。以E2質量濃度為橫坐標，以抑制率為縱坐標，對E2質量濃度取對數即以lgC（E2）繪制間接競爭抑制曲線（圖7b）。

圖7 不同質量濃度E2的SPR信號（a）和間接競爭抑制回歸曲線（bb）Fig.7 Indirect competition results (a) and indirect competitive inhibition regression curve (b)

根據3 倍信噪比（RSN=3）原理，計算出方法的最低檢出限為11.13 ng/mL。檢測范圍為15.63～500 ng/mL，y=0.200 3x－0.125 56，R2為0.996 82。

此外，將其他檢測E2的方法測定的檢出限和線性范圍同本實驗方法做了對比，結果如表1所示，和其他方法相比，本實驗擁有更低的檢測限和更寬的線性范圍。并且本實驗無需標記，可以實時觀察信號的變化和競爭的情況，一次間接競爭的過程僅需要約20 min。2.5 加標回收實驗結果

表1 其他方法和本實驗方法的比較Table1 Comparison of the developed label-free immunoassay with other reported methods for the detection of E

首先參照趙金蓮等[30]的實驗，通過高效液相色譜分析驗證了牛奶樣品中并無E2檢出，未加標準品和加了E2標準品（250、125、62.5、20.0 ng/mL）的經過簡單處理的牛奶樣品用間接競爭法計算加標回收率，每個質量濃度水平平行測定6 次。在用乙酸乙酯萃取時奶中的脂肪等有機物質可能也被萃取出來，但是由于本實驗原理依據抗原抗體特異性結合的原理，即小分子和抗原只和體系中的抗體競爭結合不會和萃取出的有機物質結合，并且在SPR檢測程序中可以去除非特異性吸附，所以牛奶中的某些脂肪等物質對加標回收率實驗影響很小。如表2所示，加標回收率在90.57%～8.47%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在4.65%～12.28%之間，說明該方法準確可靠，也證明了可能被萃取出的脂肪等有機物質不會影響實驗結果，可以用于實際牛奶樣品的測定。在實際應用中如果待檢測的樣品E2質量濃度較低時，可以采取一個富集濃縮的步驟來檢測E2殘留。

表 22 EE2加標回收實驗Table2 Recovery of E2from spiked milk

2.6 特異性實驗結果

選擇E2的功能結構和類似物：己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚、雌酮和雌三醇進行特異性實驗。將各類似物的不同質量濃度的標準溶液、5 種類似物和E2的混合液（即6 種物質全部混合，混合液中6 種物質質量濃度相同，分別是500、250、125 ng/mL）分別與E2-mAb等體積混合（混合后的最終質量濃度分別為250、125、62.5 ng/mL），然后用與2.4節相同的方法進行間接競爭法進行檢測，結果如圖8所示，抑制率反映了各目標物與E2-mAb之間的反應程度，抑制率越高，表明目標物與抗體結合的越多。所有類似物的抑制率均低于7%，表明它們幾乎不與抗體結合，并且6 種混合物的特異性與只有E2的特異性基本一致，所以其他類似物對檢測E2幾乎無影響。該方法的特異性良好。

圖8 E8 E2及其類似物的特異性實驗結果Fig.8 Specificities for E2and its analogues

3 結 論

建立了基于間接競爭法的無需標記的用于檢測E2殘留的SPR免疫傳感技術，得到了良好的回收率和線性范圍。在優化條件下，得到了15.63～500 ng/mL的線性范圍，最低檢出限為11.13 ng/mL。與傳統的檢測方法相比，樣品的前處理過程操作簡單、耗時少（單個樣品約20 min），具有可觀的應用前景。檢測中以固定在芯片上的抗原為傳感層，實現了更換抗原-抗體即可更換檢測目標物的目的，這樣使這一傳感技術有良好的通用性，即本研究提供了一種簡單實時無需標記的方法可以用于檢測其他類型的小分子。

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A Label-Free Immunoassay with a Surface Plasmon Resonance Biosensor for the Determination of Estradiol in Milk

JIA Yingtong1,2, PENG Yuan2, BAI Jialei2, ZHANG Xihao2, NING Bao’an2, GAO Zhixian2,*, CUI Jiansheng1,*
(1. School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Risk Assessment and Control Technology for Environment and Food Safety, Institute of Health and Environment Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

A surface plasmon resonance (SPR) biosensor system was developed for the determination of estradiol (E2) using an indirect competition method without labeling in real time. In the indirect competition method, the antigen (E2-BSA) was immobilized on the sensor chip surface and competed with E2in samples for binding with the antibodies. Then the SPR response decreased in the presence of E2, which prevented the coupling of antibodies and E2-BSA, and so the SPR response was inversely proportional to E2concentration. Assay parameters, including antibody concentration and number of regenerations, were optimized and E2-spiked milk samples were detected by this method. A linear relationship was obtained between inhibition percentage and common logarithmic value of E2concentration over the range of 15.63 to 500 ng/mL and the limit of detection (LOD) was 11.13 ng/mL. The present study demonstrated a simple and general strategy for label-free detection of various small molecules.

surface plasmon resonance (SPR); label-free; estradiol; real-time; indirect competition

10.7506/spkx1002-6630-201712034

X836

A

1002-6630（2017）12-0223-06

賈映彤, 彭媛, 白家磊, 等. 基于間接競爭法的表面等離子共振免疫傳感技術檢測雌二醇[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 223-228.

10.7506/spkx1002-6630-201712034. http：//www.spkx.net.cn

JIA Yingtong, PENG Yuan, BAI Jialei, et al. A label-free immunoassay with a surface plasmon resonance biosensor for the determination of estradiol in milk[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 223-228. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712034. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-20

國家自然科學基金青年科學基金項目（21207161）；國家自然科學基金面上項目（81472985）；軍隊重大專項（AWS15J006）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（15JCYBJC51200）

賈映彤（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：15614135637@163.com

*通信作者：高志賢（1966—），男，研究員，博士，研究方向為納米技術、食品安全和生物傳感器。E-mail：gaozhx@163.com崔建升（1966—），男，教授，博士，研究方向為環境監測技術。E-mail：cui1603@163.com