薛淑琴,謝思蕓,肖仔君,鐘瑞敏,,*,鄧澤元,江啟鑫
(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.韶關學院英東食品科學與工程學院,廣東 韶關 512005)
完全發酵與適度發酵蘋果醋主要成分的差異性分析
薛淑琴1,謝思蕓2,肖仔君2,鐘瑞敏1,2,*,鄧澤元1,江啟鑫2
(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌 330047;2.韶關學院英東食品科學與工程學院,廣東 韶關 512005)
研究蘋果醋分別采用適度發酵和完全發酵時主要成分及芳香物質種類和含量的差異性。采用福林-酚法、高效液相色譜法、固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用分別測定2 種發酵方式蘋果醋中總酚、有機酸含量和芳香成分。結果表明,適度發酵蘋果醋總酚含量比完全發酵高21%;2 種果醋的有機酸種類完全一致,但適度發酵法中的酒石酸、檸檬酸和富馬酸含量更高,而丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸和琥珀酸的含量則略低于完全發酵的醋樣。適度發酵蘋果醋芳香物質種類更豐富,檢測到37 種芳香成分,其中保留了不少原果香氣,如香茅醇、橙花醇、乙酸丁酯、乙酸-4-甲基-3-己酯和乙酸二甲基丁酯等。適度發酵可減少蘋果醋總酚的損失,同時保留了更多的蘋果原香物質,是值得探索改善蘋果醋品質的途徑。
蘋果醋;適度發酵;完全發酵;總酚;有機酸;芳香物質
蘋果醋是醋飲料、調味品和功能食品行業廣泛使用的重要原料,2014年我國果醋年產量已接近15萬 t,其中蘋果醋是產量最大的品種[1]。我國市場上蘋果醋飲料的種類繁多,真正以發酵為基礎的蘋果醋并不多見,大多為純原料調配型蘋果醋飲料,有的甚至是用醋精、糖精、香精調配而成[2]。
蘋果醋以蘋果汁為原料,通過酒精發酵和醋酸發酵完成釀造,全球工業化生產果醋主要采用液體深層發酵技術為主[3-4]。果醋的營養風味品質主要來源于糖類等成分在發酵過程中微生物的轉化與代謝副產物,以及水果原有的植物營養素、天然原果香氣、天然色素和維生素等,而糖類完全轉化為醋酸固然重要,但不應是根本目的[5]。相反,在好氧的醋酸發酵階段,在滿足果醋產品乙酸轉化率指標后,如能縮短發酵時間實行適度發酵,控制發酵過程中酒精體積分數和乙酸濃度,避免持續氧化代謝所形成的不良風味,盡量減少發酵基質中長時間的化學氧化作用對多酚等植物營養素、天然原果芳香和天然色素等的破壞,將顯著提升果醋的保健和風味品質。
有機酸是蘋果醋中重要的營養、風味和特征成分,賦予了果醋特有的風味[6]。有機酸的來源有兩部分;一部分是蘋果原料中固有的,如酒石酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸;一部分是發酵產生的,如乳酸、丙酮酸、乙酸、α-酮戊二酸等[7-9]。揮發性香氣成分是構成香味的主要方面,是果醋直觀和重要的感官品質[10-12]。果醋中的揮發性芳香成分主要有酸、醇、酯、醛、酮、萜、萜烯類[13-14]等。
目前鮮見蘋果醋采用適度發酵改善品質的研究報道。本實驗通過對適度發酵和完全發酵蘋果醋中總酚、有機酸以及芳香物質種類和含量的差異性分析,旨在探索蘋果醋采用適度發酵以提高其品質這一新途徑的科學依據。
1.1 材料與試劑
蘋果 市購;活性干酵母(LALVIN/ICV 71B)法國拉曼公司;惡臭醋酸桿菌 廣東省菌種保藏中心;酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸有機酸標準品 北京百靈威科技有限公司;甲醇(色譜純) 天津市科密歐試劑有限公司;福林-酚試劑 上海荔達生物科技有限公司;沒食子酸標準品 美國Sigma公司。
1.2 儀器與設備
BIOQ-20L發酵罐 上海匯和堂生物工程有限公司;高效液相色譜儀(SPD-16雙波長紫外檢測器、Shimadzu數據處理系統)、QP 2010-Ultra氣相色譜-質譜聯用儀、AUW 120D分析天平 日本島津公司;57328-U固相微萃取頭、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/ CAR/PDMS)萃取纖維、手動進樣手柄 美國Supelco公司;TGL-20M-Ⅱ高速冷凍離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司;Omni-G超純水發生器 銳思捷科學儀器有限公司;TU-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。
1.3 方法
1.3.1 完全發酵蘋果醋
以蘋果為原料,經洗凈、熱燙、護色、榨汁、酶解、過濾等工序得到蘋果原汁。將蘋果原汁糖度調整為20%,添加果汁質量0.08%的活性干酵母在28 ℃條件下發酵。發酵至136 h后,酒精體積分數不再變化,濾掉酵母泥進行醋酸發酵,接種果酒體積分數10%的醋酸菌于蘋果酒中,發酵至168 h后,醋酸酸度不再上升,停止發酵。
1.3.2 適度發酵蘋果醋
調整蘋果原汁糖度至15%,添加果汁質量0.04%的活性干酵母在28 ℃條件下發酵,48 h發酵終止。濾掉酵母泥進行快速醋酸發酵,接種果酒體積分數7%的醋酸菌于蘋果酒中,當發酵48 h酸度達到2%時停止發酵。
1.3.3 蘋果醋中總酚含量的測定[15]
準確稱取沒食子酸標準品12.1 mg,甲醇定容至100 mL。精密吸取1、2、3、4、5、6、7 mL沒食子酸標液,加水稀釋定容于10 mL棕色容量瓶得不同質量濃度標液,分別取1 mL不同質量濃度標液加水稀釋,加入0.6 mL福林-酚試劑,渦流,3 min后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL,30 ℃避光反應60 min。于波長750 nm處測吸光度,以吸光度為縱坐標,沒食子酸標樣質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線。繪制標準曲線得回歸方程為y=0.185 04x+0.155 7(R2=0.995)。取1 mL樣液按標準方法測定。計算完全發酵和適度發酵蘋果醋中總酚含量。1.3.4 蘋果醋中有機酸含量的測定
有機酸含量的測定參考余永建[16]、向進樂[17]等的方法略作改動。精確稱取酒石酸0.1 g、丙酮酸0.05 g、蘋果酸5 g、α-酮戊二酸0.5 g、乳酸0.2 g、乙酸10 g、檸檬酸0.25 g、富馬酸0.01 g、琥珀酸0.4 g;超純水溶解,定容于100 mL。配制成混合標準溶液。分別取0.1、0.2、0.5、2、4、6、8 mL混合標準溶液,超純水定容于100 mL。得到不同質量濃度的混合標準溶液。系列梯度混合標準液過0.22 μm水系濾膜后采用高效液相色譜法對其進行測定分析,以峰面積(X)對質量濃度(Y)求回歸方程,繪制標準曲線。
1.3.4.1 色譜條件
色譜柱:Inertsail ODS-4(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液(磷酸調pH值至2.8),流動相過0.22 μm水系濾膜,流速1.0 mL/min,檢測波長210 nm,進樣量10 μL。
1.3.4.2 樣品溶液的制備
分別取完全發酵24、48、72、96、120、144、168 h;適度發酵10、18、24、34、42、48 h的蘋果醋樣品,12 000 r/min高速冷凍離心10 min,濾液過0.22 μm水系濾膜。濾液上機分析(10 μL),外標法定量。
1.3.5 蘋果醋揮發性物質的測定
1.3.5.1 固相微萃取
在2 0 m L裝有磁力攪拌子的頂空瓶中加入1.00 g NaCl,5 mL適度發酵48 h蘋果醋液和完全發酵168 h蘋果醋液,50 ℃平衡10 min,插入PDMS纖維頭,50 ℃吸附40 min,氣相色譜-質譜進樣口解吸5 min。
1.3.5.2 色譜條件
色譜柱:Rxi-5sil MS毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣He,流量1 mL/min;進樣口溫度250 ℃;程序升溫:起始柱溫35 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升溫至80 ℃,保持1 min,再以8 ℃/min升溫至180 ℃,保持2 min,以16 ℃/min升溫至240 ℃,保持1 min;分流比10∶1。
1.3.5.3 質譜條件
電子電離源;離子源溫度220 ℃;接口溫度250 ℃;質量掃描范圍m/z 35~500。通過質譜解析以及與NIST14 a.L譜庫進行比對,確定各易揮發成分的結構,并采用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。
1.4 數據處理
采用SPSS 19數據處理軟件對實驗結果進行處理,結果用±s表示。
2.1 適度發酵蘋果醋和完全發酵蘋果醋總酚含量的變化

圖1 適度發酵與完全發酵蘋果醋中總酚含量的差異Fig.1 Comparison of total phenol contents in moderately and entirely fermented apple vinegar
由圖1可以看出,適度發酵和完全發酵蘋果醋中,隨著發酵時間的延長,2 種不同發酵方式中的總酚含量均下降,醋酸菌屬于好氧菌,這是由于在醋酸發酵階段,發酵過程中提供充足的氧氣,發酵液中易受到氧化的維生素和酚類物質發生不可避免的損失[18]。完全發酵蘋果醋中酚類物質的損失較適度發酵更為嚴重,完全發酵蘋果醋基料蘋果汁的固形物含量較高,在酒精發酵階段,高濃度的糖含量對酵母菌的抑制作用比較顯著,果汁中的酚類物質沒有很好的溶出;醋化階段,長時間的好氧發酵使得酚類的損失很大,發酵結束,總酚含量僅為48.63 mg/100 g。適度發酵果醋基料蘋果汁中固形物含量調整到合適的濃度,酒精發酵階段,酵母菌的生長比較旺盛,可溶性酚類物質由于酵母菌的疏松作用溶出[19],醋化階段,明顯縮短了發酵時間,避免了發酵液長時間的通氧,所以總酚的損失較低。發酵結束,總酚含量為58.27 mg/100 g。
2.2 適度發酵和完全發酵過程中9 種有機酸含量的變化


圖2 適度發酵和完全發酵蘋果醋9 種有機酸含量的變化Fig.2 Changes in the contents of nine organic acids in moderately and entirely fermented apple vinegar
酒石酸是蘋果果實和發酵產物中共有的有機酸,由圖2a可知,發酵初期,酒石酸含量增加,這可能是發酵體系中pH值偏低,pH值越低,酒石酸鹽的溶解度越大,能檢出的酒石酸含量就越高,酒石酸含量增加[20]。所以,適度發酵中酒石酸含量顯著增加。而完全發酵后期,酒石酸含量顯著下降,可能是酒石酸鹽沉淀、酒石酸氧化降解[21]。
丙酮酸是生物體基本代謝的產物之一,如圖2b所示,適度發酵中,丙酮酸含量下降顯著,可能是適度發酵的營養基質更加適宜醋酸菌生長代謝,醋酸菌的代謝旺盛。完全發酵后期,丙酮酸的含量顯著下降。
α-酮戊二酸是微生物代謝產生的微量有機酸[22],如圖2c所示,適度發酵和完全發酵中,α-酮戊二酸較發酵開始含量顯著增加,完全發酵中α-酮戊二酸含量顯著高于適度發酵,可能是在酒精發酵階段,完全發酵時間長,酵母菌積累更多的α-酮戊二酸。適度發酵過程后期,α-酮戊二酸的變化趨勢較緩。
蘋果酸是蘋果醋中的特征性有機酸,如圖2d所示,適度發酵中,蘋果酸含量先顯著增加,后降低。完全發酵過程中蘋果酸的減少量更為顯著,可能是到發酵后期,醋酸菌的營養底物被不斷消耗,蘋果酸作為碳源而被消耗。
乳酸是發酵產生的有機酸,如圖2e所示,酒精發酵階段,乳酸大量積累,所以,完全發酵中乳酸含量高于適度發酵。適度發酵到中期,乳酸含量顯著下降,可能是醋酸發酵階段,醋酸菌的作用,抑制了乳酸菌的活性,醋酸菌把前期積累的乳酸當做營養底物而消耗。完全發酵中,發酵初期,乳酸含量下降顯著,隨后,乳酸含量變化不顯著。
乙酸發酵階段,酒精作為底物,將其轉化為乙酸,乙酸含量顯著升高。由圖2f可知,適度發酵和完全發酵醋酸的變化趨勢一致。適度發酵中乙酸含量達到1 494.36 mg/100 g。完全發酵中乙酸含量達2 806.18 mg/100 g。
如圖2g所示,完全發酵中檸檬酸含量有所增加,可能是發酵過程從皮渣中溶出。適度發酵檸檬酸的變化不顯著。
如圖2h所示,富馬酸含量變化不顯著。富馬酸含有不飽和的碳碳雙鍵結構,完全發酵過程中,持續的通氧可能有氧化損失。適度發酵法富馬酸含量的變化不顯著。
琥珀酸是動物、植物以及微生物中的一種常見的中間代謝產物[23]。由圖2i可知,發酵初期,完全發酵蘋果醋中琥珀酸含量高于適度發酵蘋果醋,這可能是在酒精發酵階段,酵母菌進行厭氧呼吸,琥珀酸是糖類轉化為酒精時積累的副產物。在醋酸發酵階段,完全發酵和適度發酵中琥珀酸含量顯著下降,這可能是氧化降解。
2.32 種發酵蘋果醋揮發性成分比較分析
對2 種發酵方式發酵終止后樣品和發酵前的蘋果汁芳香物質進行了固相微萃取聯合氣相色譜-質譜法比較分析,如圖3所示,對相對含量高于0.05%以上各組分經檢索分析,各成分相對含量見表1。液態深層適度發酵與完全發酵蘋果醋芳香物質存在明顯差異。

圖3 蘋果汁和蘋果醋芳香物質GC-MS總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of volatile aromatic components in apple juice and apple vinegar

表1 適度發酵和完全發酵蘋果醋香氣成分Table1 GC-MS analysis results of aromatic components in apple vinegar samples prepared by moderate and entire fermentation methods

續表1
如表1所示,適度發酵的蘋果醋樣品芳香物質豐富性明顯優于完全發酵。適度發酵蘋果醋中鑒定出37種香氣成分,其中有11 種酯類(總相對含量為63.72%)、8 種醇類(10.26%)、6 種醛酮類(4.15%)、7 種萜烯類(3.04%)和3 種酸類(17.15%)。而完全發酵樣品只鑒定出22 種成分,其中有7 種酯類(19.14%)、1 種醇類(55.07%)、9 種醛酮類(23.74%)、2 種萜烯類(0.75%)和1 種酸類(0.45%)。導致這種情況的主要原因是適度發酵保留了較多蘋果汁和前期果酒的原香成分,如己醇、2-庚醇、(±)-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、1,3-辛二醇、乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丁酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香茅醇、大馬士酮、反-橙花叔醇等蘋果汁或酒中成分有一定程度保留,而在完全發酵醋樣中這些成分則完全消失。這種果汁、果酒原香風味在液態深層完全發酵果醋中損失的情況比較普遍,主要與完全發酵長時間供氧的氧化作用和蒸騰作用有關,這也是液態深層完全發酵蘋果醋缺乏蘋果原香特性的主要原因[24-26]。
適度發酵與完全發酵蘋果醋芳香特征成分的種類及相對含量也存在很大差異。適度發酵醋樣相對含量比較高的芳香特征成分包括:乙酸-4-甲基-3-己酯(40.32%)、乙酸異戊酯(11.89%)、癸酸(10.75%)、辛酸(6.30%)、乙酸苯乙酯(6.12%)、乙酸-2-甲基丁酯(3.46%)、苯乙醛(2.06%),其中大部分是酯類成分,相對含量總和達到63.72%。完全發酵蘋果醋樣特征成分包括:苯乙醇(55.07%)、乙酸苯乙酯(14.75%)、苯甲醛(13.65%)、苯乙醛(3.91%)、乙酸-4-甲基3-己酯(3.28%)、對乙基苯甲醛(3.10%),大部分為醇類和醛酮類,總和達到78.81%,而酯類成分總和僅有19.14%。從感官品評結果,適度發酵蘋果醋除了保留明顯的蘋果原香特性外,香感比較柔和,而完全發酵醋樣香感具有一定刺激性[27-30],且基本沒有蘋果原香。
從以上分析結果來看,發酵方式的不同確實會對蘋果醋風味成分的種類、相對含量及相互間的比例產生重大影響,進而影響到各自的風味特性。適度發酵與完全發酵方式在初始發酵基料的成分(如酒精體積分數、含糖量等)、發酵時間和供氧量上存在很大區別,會影響醋酸菌的繁殖和代謝特性,最終影響到原香風味成分的保留以及代謝性芳香物質種類與含量,這方面值得以后繼續深入研究。
通過對比適度發酵和完全發酵過程中蘋果醋總酚含量的變化,發現完全發酵蘋果醋中總酚的損失較為嚴重,而適度發酵蘋果醋的營養基質更加適宜酵母菌、醋酸菌生長、繁殖,果皮、渣中的總酚能夠更好的溶出,而且明顯縮短了發酵時間,避免了總酚的大量損失。
完全發酵和適度發酵中有機酸的種類一致,酒石酸、檸檬酸、富馬酸含量高于完全發酵,丙酮酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、琥珀酸含量略低于完全發酵,適度發酵中乳酸、丙酮酸、乙酸含量顯著低于完全發酵,從保留蘋果醋營養價值而言,適度發酵法是可行的。
2 種不同發酵方式制備的蘋果醋樣品風味特性存在較大差異。適度發酵蘋果醋中共檢測到37 種揮發性香氣成分,完全發酵樣品僅檢測到22 種,前者芳香風味成分豐富性有明顯優勢,而且結合實際的感官品評的情況,適度發酵蘋果醋在原果香風味成分的保留、特征風味成分種類、相對含量及相互之間的比例等方面比完全發酵的蘋果醋更易于形成高質量的產品。
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Analysis of Differences in the Chemical and Aroma Profiles of Apple Vinegar Prepared by Moderate and Entire Fermentation Methods
XUE Shuqin1, XIE Siyun2, XIAO Zijun2, ZHONG Ruimin1,2,*, DENG Zeyuan1, JIANG Qixin2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Yingdong College of Food Science and Technology, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China)
The differences in the chemical and aroma profiles of moderately and entirely fermented apple vinegar were investigated. The total phenols content, and organic acid and aroma prof i les were determined and analyzed using Folin-Ciocalteu colorimetry and high performance liquid chromatography (HPLC), respectively. The volatile aroma components were extracted by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The total phenols content in the moderately fermented sample was 21% higher than that in the entirely fermented one. The organic acids species in two vinegar samples were exactly the same, but their contents were different. The moderately fermented vinegar contained higher levels of tartaric acid, citric acid and fumaric acid while the entirely fermented one contained higher levels of pyruvic acid, malic acid, α-ketoglutaric acid, lactic acid, acetic acid and succinic acid. The moderate fermentation could provide the vinegar with more abundant aroma-active compounds. A total of 37 volatile compounds were detected, including citronellol, nerol, butanoic acid ethyl ester, 4-methyl-3-hexyl acetate ester, and 2-methylbutyl acetate, which were also detected in the apple juice. The moderate fermentation method could be an effective way to develop apple vinegar with high quality because of its protective effects on total phenols and aroma compounds.
apple vinegar; moderate fermentation; entire fermentation; total phenol; organic acid; aroma compounds
10.7506/spkx1002-6630-201712021
TS264.22
A
1002-6630(2017)12-0137-07
薛淑琴, 謝思蕓, 肖仔君, 等. 完全發酵與適度發酵蘋果醋主要成分的差異性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(12): 137-143.
10.7506/spkx1002-6630-201712021. http://www.spkx.net.cn
XUE Shuqin, XIE Siyun, XIAO Zijun, et al. Analysis of differences in the chemical and aroma profiles of apple vinegar prepared by moderate and entire fermentation methods[J]. Food Science, 2017, 38(12): 137-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201712021. http://www.spkx.net.cn
2016-09-01
廣東省公益研究與能力建設專項(2015A010107018);國家級大學生創業實踐項目(201410576002)
薛淑琴(1989—),女,碩士研究生,主要從事營養與食品衛生研究。E-mail:xsqjybs@163.com
*通信作者:鐘瑞敏(1967—),男,教授,博士,主要從事食品低溫處理與精深加工研究。E-mail:2557563933@qq.com