1 株產藍色素真菌F10的ITS序列及其色素性質分析

趙麗芳，馬翠云，羅海瀾，王 飛1,,*

（1.漯河醫學高等專科學校 漯河市醫學生物工程重點實驗室，河南 漯河 462002；2.漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 漯河 462002；3.漯河醫學高等專科學校食品營養系，河南 漯河 462002）

1 株產藍色素真菌F10的ITS序列及其色素性質分析

趙麗芳1,2，馬翠云3，羅海瀾2，王 飛1,3,*

（1.漯河醫學高等專科學校 漯河市醫學生物工程重點實驗室，河南 漯河 462002；2.漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南 漯河 462002；3.漯河醫學高等專科學校食品營養系，河南 漯河 462002）

從贛南野生松木上分離到1 株產藍色素真菌F10，該菌經鑒定為葡萄糖座科Pseudofusicoccum屬。為研究F10產生的藍色素的 性質，實驗采用不同pH值、溫度、光照、金屬離 子、氧化劑和還原劑處理藍色素，結果表明，該藍色素對光照、溫度、氧化劑都不敏感，對pH值、金屬離子、還原劑敏感，推測這幾種因素可能改變了色素的化學結構。為確定該藍色素的結構成分，采用高效液相色譜串聯質譜、紅外光譜法對其進行鑒定，結果表明該色素為芳香族羧酸類化合物。

葡萄糖座科Pseudofusicoccum屬；藍色素；性質

色素即著色劑，是印染工業和食品添加劑的一個重要組成部分[1]。色素一般分為合成色素和天然色素。雖然合成色素占據市場的主導地位，但是隨著合成色素具有毒性、致癌性，甚至可能導致對重要機體損傷的報道，其安全性成為消費者關注的最大熱點[2-4]。比較而言，天然色素具有安全可靠、無毒副作用、色調自然等優點，某些天然色素還有抗腫瘤及其他生理功能[5-8]，越來越受到關注。微生物色素因生產不受資源、環境和空間的限制，具有植物色素和動物色素無可比擬的優越性[9-10]。在自然界中微生物能產生色素的種類豐富，但在發酵工業中得到應用的為數不多，國際上被正式批準生產的天然藍色素種類很少，而用微生物發酵生產的藍色素更是罕見[11]。

天然藍色素中有的具有抑菌作用（主要對革蘭氏陽性菌），如放線紫素和石蕊殺菌素；有的具有保健功能，如花青素[12-14]，有的作為酸堿指示劑[8]。目前真菌產藍色素的研究還鮮見報道。對江西野外松木中分離得到的1 株產藍色素的真菌F10進行了生物學鑒定，經鑒定為葡萄糖座科Pseudofusicoccum屬，優化了產色素條件，對藍色素的穩定性及結構進行了分析[15-16]，以期為開發利用天然藍色素資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株F10由江西野外松木中分離得到。

基礎接種培養基為馬鈴薯蔗糖瓊脂（potato saccharose agar，PSA）培養基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、ddH2O1 000 mL；發酵培養基為馬鈴薯蔗糖（potato saccharose，PS）培養基。

氯化銨、甘氨酸、硝酸鉀、尿素、ZnSO4、MgSO4、Fe2(SO4)3天津市津東天正精細化學試劑廠；水解乳蛋白和酵母膏 北京奧博星生物技術有限責任公司；甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、丙酮、石油醚天津市四友精細化學品有限公司；Pfu高保真酶、底物、總DNA提取試劑盒 北京全式金生物技術公司；分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

RE2A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Varian cary 100型紫外-可見分光光度計、高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用儀 美國Agilent公司；低溫高速離心機 德國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 F10菌株培養

固體培養：將保 存于4 ℃ PSA斜面的F10菌株接種于PSA平板上，28 ℃培養3 d。

發酵培養：無菌條件下，用打孔器接種直徑6 mm、菌齡一致的F10菌塊于裝有100 mL PS培養基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r/min培養7 d。

1.3.2 F10菌株ITS鑒定

利用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取F10菌株的基因組[17-18]，取少許新鮮菌絲體，加液氮研磨，加入2 mL 2% CTAB，重新懸浮；加入200 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕輕混勻，65 ℃水浴45 min，13 000 r/min離心10 min；取上清液加入一新離心管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V），12 000 r/min離心10 min；吸上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），12 000 r/min離心10 min；將上清液小心吸入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，－20 ℃放置1 h，12 000 r/min離心10 min；棄上清液，用冰冷的70%乙醇清洗沉淀，顛倒離心管數次，12 000 r/min離心5 min，重復洗滌一次后，超凈工作臺中室溫干燥；加入40 μL滅菌的ddH2O溶解，－20 ℃條件下保存，備用。利用提取的總DNA對轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）保守序列進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增獲得目的基因片段。核糖體RNA基因間隔區ITS常用于真菌類的分子生物學鑒定，采用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），PCR體系：10×Buffer5 μL、10 mmol/L dNTP4 μL、引物各l μL、Pfu酶l μL（5 U/μL）、模板DNA1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢驗后送上海生工生物技術公司進行測序。

1.3.3 培養條件優化

PS培養基添 加質量濃度為20 g/L的不同碳源，如淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖等，培養7 d，確定最佳碳源；在最佳碳源培養條件下添加質量濃度為2 g/L的不同氮源，如氯化銨、硝酸鉀、尿素、甘氨酸、水解乳蛋白、酵母提取物等；在最佳碳源時分別用3 mol/L HCl溶液和6 mol/L NaOH溶液調pH值為5、6、7、8、9、10，確定最佳初始pH值；所有處理設3 個重復。接種后置于28 ℃條件下搖床培養7 d，測菌體生長量和產色素量。菌體生長量用菌絲干質量表示，鮮菌體去離子水洗2 遍，于60 ℃烘箱中烘至恒質量后稱量。收集發酵液，在580 nm波長處測定其OD值，此為胞外色素；稱取等量的鮮菌絲體，利用超聲波破碎，8 000 r/min離心10 min收集上清液，測定其OD580nm，此為胞內色素。

1.3.4 色素在不同溶劑中的溶解性

各稱取濕菌體1 g入50 mL離心管中，分別加入ddH2O、甲醇、乙醇、二氯甲烷、二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、丙酮、石油醚各15 mL，在400 W、間歇2 s、破碎1 s的條件下，超聲破碎30 min，8 000 r/min離心15 min取上清液，進行全波長掃描。

1.3.5 色素的穩定性

1.3.5.1 pH值對藍色素穩定性的影響

將色素分別溶于pH 3、4、5、6、7、8、9、10的水溶液中，混勻，靜置12 h，觀察pH值對藍色素的影響，在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，根據下式計算殘存率（residual rate，RSR）：

1.3.5.2 光線對藍色素穩定性的影響

將1.3.5.1節中RSR最高的色素溶液分為3 份，一份置于室內自然光下，分別在0、4、8 h后，在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，計算RSR；一份置于紫外燈下，分別在0、20、40、60、80、100 min后，在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，計算RSR；一份置于黑暗中，分別在0、12、24 h后，在200～800 nm波長范圍內進行光譜掃描，計算RSR。

1.3.5.3 溫度對藍色素穩定性的影響

將1.3.5.1節中RSR最高的色素溶液，分別在室溫、20、60、80、100 ℃恒溫水浴中放置1 h，冷卻至室溫后進行定容，測最大吸收峰的OD值，計算RSR。

1.3.5.4 金屬離子對藍色素穩定性的影響

將1.3.5.1節中RSR最高的色素溶液，分別加入Mg2+、Fe3+、Zn2+3 種金屬離子，使金屬離子濃度為0.1 mol/L，搖勻，靜置90 min后，以不加金屬離子的色素溶液為對照，測最大吸收峰處的OD值，計算RSR。

1.3.5.5 氧化劑和還原劑對藍色素穩定性的影響

在OD580nm為2.9的藍色素水溶液中分別添加氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3，使H2O2和Na2SO3的終質量分數為0.2%、0.4%、0.6%，室溫靜置1 h后，測最大吸收峰處的OD值，計算RSR。

1.3.6 色素的提取及純化鑒定

菌絲冷凍干燥，加入酸性pH 5的二氯甲烷，振蕩浸提20 min，過濾，水洗除去稀鹽酸，合并有機相，無水MgSO4干燥，減壓除溶劑，得色素粗品，進行薄層層析。硅膠柱層析分離，采用石油醚-二氯甲烷（分別為4∶1、2∶1、2∶3、0∶1，V/V）2 倍柱體積進行洗脫，接著pH 5的二氯甲烷-甲醇（分別為500∶1、250∶1、200∶1、100∶0.8、100∶1、100∶1.5、50∶1，V/V）梯度洗脫獲得純品，HPLC-MS、紅外光譜等對其進行初級結構鑒定。

1.4 數據處理

檢驗正態分布和單因素方差分析（o n e-w a y ANOVA）檢驗處理間均值差異，顯著性由統計軟件SAS 8完成，用Microsoft Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 F10 ITS片段的序列測定及進化樹分析

漯河市醫學生物工程重點實驗室于2013年分離到菌株F10，對其進行分子生物學鑒定。用引物以菌株F10的基因組DNA為模板，進行PCR擴增其ITS序列，擴增結果送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。序列提交GenBank，獲登錄序列號FJ888472.1。與NCBI上相似序列經BLAST比對的結果表明：該菌株與Pseudofusicoccum屬的Pseudofusicoccum violaceum的ITS序列相似度為98%，與Pseudofusicoccum ardesiacum的ITS序列相似度為95%。根據比對結果，在GenBank中選取與F10 ITS序列相似度高的菌株構建系統發育樹，結果顯示，F10與Pseudofusicoccum violaceum構成一支。該菌氣生菌絲的著色隨真菌和孢子的生長由灰白色變為黑色（圖1A），在培養皿背面顏色逐漸變藍灰色（圖1B），最終變為藍黑色，氣生菌絲頂端形成頭狀孢囊梗（圖1C），產生透明孢囊（圖1D）。

圖1 F10菌落、孢囊梗及孢囊形態特征Fig.1 Colonial morphology, sporangiophore and sporscyst of F10

圖2 根據菌株F10 ITS序列與相似菌相應序列構建進化樹Fig.2 Multifurcating phylogenetic tree indicating the overall relationship between F10 ITS sequence and other homologous sequences

利用序列比對軟件ClustalX1.83和系統發育分析軟件PHYLIP3.68使用Neighbor-Joining法構建系統進化樹，TreeView軟件示圖如圖2，進化分析（圖2）并結合形態特征分析確定F10屬于葡萄座科Pseudofusicoccum屬。

2.2 碳源對F10菌生長量和產色素量的影響

圖3 碳源對F10菌體生長量、胞外色素及胞內色素產量的影響Fig.3 Effect of carbon sources on the growth of Pseudofusicoccum F10 and the production of intracellular and extracellular pigments

無菌條件下，用打孔器接種直徑6 mm、菌齡一致的F10菌塊于不同碳源的PS液體培養基中，28 ℃、200 r/min培養7 d。如圖3所示，就菌體生長量來看，碳源的選擇依次為淀粉、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和甘油；甘油作為碳源不產色素，碳源為麥芽糖和淀粉時的色素產量高，其次為蔗糖和葡萄糖。綜合菌體生長量及色素產量，麥芽糖為F10的最佳碳源，從成本考慮，淀粉和蔗糖也是不錯的選擇[19]。

2.3 氮源對F10菌生長量和產色素量的影響

圖4 氮源對F10菌體生長量、胞外色素及胞內色素產量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on the growth of Pseudofusicoccum F10 and the prod uction of intracellular and extracellular pigments

綜合菌體生長、產色素量及成本考慮，本次實驗以蔗糖為碳源。后續最佳氮源優化實驗中（圖4），與對照相比添加氮源對菌體生長及產色素量都沒有促進作用。相反，添加NH4Cl和酵母膏后F10不產色素，其他幾種氮源的加入也減少了色素的產生，這可能是PS培養基中原有的氮源足以滿足F10色素的產生，多余的氮源反而會抑制F10色素的產生。這一現象與在放線菌Gordonia amicalis y1上的實驗結果相似[20]。

2.4 初始pH值對F10菌生長量和產色素量的影響

圖5 初始pH值對F10菌體生長量及產胞內外色素量的影響Fig.5 Effect of initial pH value on the growth of Pseudofusicoccum F10 and the production of intracellular and extracellular pigments

培養基的初始pH值對F10菌生長量和產色素量均有影響，如圖5所示。菌株在中性環境（pH 7）中生長量和胞內色素產量最高；當初始pH 5時，胞內色素產量較高；在初始pH 9時，色素產量較低；當初始pH 3時，只有少量菌體生長，沒有色素產生；當初始pH 11時，沒有菌體生長，說明過酸過堿的環境都不利于F10的生長和色素產生。

2.5 色素在不同溶劑中的溶解性

菌株F10同時能產胞內、外藍色素，從前面的實驗結果看，F10胞內色素產量遠大于胞外色素。因此，本實驗利用超聲破碎法獲得胞內色素，并觀察胞內色素在不同溶劑中的溶解性，結果顯示，胞內色素易溶于DMF和水，呈靛藍色；微溶于二氯甲烷、甲醇、乙醇，呈淡藍色；不溶于丙酮、石油醚等。由此可見，該藍色素易溶于極性強的溶劑，不溶于極性小的溶劑。

2.6 藍色素的穩定性

2.6.1 pH值對藍色素穩定性的影響

圖6 pH值對藍色素穩定性的影響Fig.6 Effect of pH value on blue pigment stability of Pseudofusicoccum F10

由圖6可知，該色素在堿性（pH 10）水溶液中為暗紫紅色，在偏堿性（pH 8～9）水溶液中呈藍灰色；在中及酸性水溶液中為藍色，在中性溶液中溶解度最好，pH 3～4酸性水溶液中色素溶解度變小，以沉淀析出。

2.6.2 光線對藍色素穩定性的影響

取等量的pH 7的藍色素水溶液分別置于日光、紫外光以及黑暗中處理，研究光線對藍色素的影響，結果顯示色素在日光和黑暗中有少量降解，而紫外光線卻對其沒有降解作用。

2.6.3 溫度對藍色素穩定性的影響

圖7 不同溫度對藍色素穩定性的影響Fig.7 Effect of temperature on blue pigment stability of Pseudofusicoccum F10

由圖7可知，藍色素在80 ℃條件下RSR有所下降，到100 ℃時RSR與室溫相比沒有顯著變化，表明藍色素的熱穩定性較好。

2.6.4 金屬離子對藍色素穩定性的影響

圖8 金屬離子對藍色素穩定性的影響Fig.8 Effect of metal ions on blue pigment stability of Pseudofusicoccum F10

由圖8可知，加入金屬離子后RSR明顯下降，但幾種金屬離子對藍色素的影響數據間差異不顯著。推測可能是金屬離子改變了藍色素基團間的空間結構導致。

2.6.5 氧化劑與還原劑對藍色素穩定性的影響

由圖9可知，添加0.6% H2O2時藍色素的RSR為99%，說明氧化劑對該色素的穩定性沒有影響；而低質量分數的還原劑Na2SO3就對該色素有很強的破壞作用，當還原劑Na2SO3的質量分數為0.6%時色素的RSR僅為1.64%，說明還原劑可能破壞了該色素的立體結構，或改變了其基團的親水性，進而影響了其穩定性。

圖9 氧化劑與還原劑對藍色素穩定性的影響Fig.9 Effects of oxidizers and reductants on blue pigment stability of Pseudofusicoccum F10

2.7 色素的提取及純化鑒定

圖10 藍色素薄層層析圖Fig.10 TCL of the blue pigment from Pseudofusicoccum F10

圖11 藍色素的HPLC-MS鑒定分析Fig.11 HPLC-MS analysis of the blue pigment from Pseudofusicoccum F10

因DMF的沸點較高，實驗采用酸性二氯甲烷萃取比移值為0.54組分的色素（二氯甲烷-甲醇體積比2∶1）（圖10），并用旋轉蒸發儀濃縮提取的色素；采用柱層析法進行分離，獲得色素純品（0.114 g/L）。利用HPLCMS、紅外色譜對物質進行鑒定。由圖11可知，產物為羧酸類化合物（m/z 318、274的碎片峰）。

上述結論可以從紅外光譜分析（圖12）得到驗證，3 423 cm－1為羧酸中締合的O—H，峰形寬而散，吸收強度中；羧酸分子中的雙分子締合，使得C=O的吸收峰向低波數方向移動，因此，1 719 cm－1為C=O吸收峰，肩峰，吸收強度中；1 304、1 226 cm－1為C—O的伸縮振動峰，肩峰，吸收強度中。3 100～3 000 cm－1附近，有較弱的峰，吸收強度較弱，但1 582、1 542、1 500 cm－13 處中強峰，則可鑒定含有苯環，即產物為芳香化合物。雖然，3 000～2 850 cm－1之間表示CH3中C—H伸縮振動的多重峰較弱，但1 427 cm－1處，多重峰，吸收強度中，則為CH3中C—H彎曲振動。以上可以說明產物為芳香族羧酸類化合物。

圖12 藍色素的紅外光譜分析Fig.12 FT-IR spectrum of the blue pigment from Pseudofusicoccum F10

3 討 論

紅、黃品系的天然色素來源較多，而藍色素則較罕見。目前，報道的產藍色菌多為放線菌[21-22]，產藍色素的真菌鮮見報道。本實驗室從野外分離到1 株產藍色素真菌F10，經形態和分子鑒定，確定該藍色素產生菌為葡萄座科Pseudofusicoccum屬。葡萄座腔菌科是子座中或子囊中產生雙腔壁的真菌的總稱；囊實體由單腔形式到多腔結構；子囊圓柱形或者通常多個形狀、棍棒狀，經常具有不明確的頸，子囊孢子透明，單細胞；該類真菌是農業和林業上重要的病原菌、內生真菌或潛在的致病菌，寄主范圍廣，分布于全球，在生態系統中占有重要的地位[23]。但該屬中產藍色素的菌鮮見報道。

實驗結果表明，該色素易溶于中性偏堿性（pH 7～9）溶液，溶于酸性溶液和極性大的有機溶劑，不溶于非極性溶劑，這與天藍色鏈霉菌所產藍色素的溶解性相似[24]。該色素的光、熱及氧化劑的穩定性都較好，但對還原劑和金屬離子敏感。說明該色素基團比較穩定，這與本實驗結構分析結果為羧酸類化合物相印證。該藍色素對紫外光、熱，特別是氧化劑的高穩定性，為其今后在食品加工、印染[25-26]、化妝品等方面的應用奠定了良好的基礎。

實驗中該真菌生長最適碳源為淀粉，在葡萄糖為唯一碳源時生長量最低，應當是F10適應于在野生叢林環境生態的結果。微生物對于生長所必需的最適碳源的選擇應依賴自身的酶系統，結果中F10以淀粉為碳源生長量最大可能是因為其淀粉酶的優先表達；而葡萄糖作為唯一碳源時生長量最低或是因為葡萄糖本身對其生長存在一定的抑制。

由于本研究中菌株F10為野生株，擬進一步進行菌種誘變選育，以提高其色價相對單位；并對藍色素開展毒理學評價，以便該藍色素能應用于行業生產。

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Identification of a Fungal Strain F10 Producing Blue Pigment and Properties of the Pigment

ZHAO Lifang1,2, MA Cuiyun3, LUO Hailan2, WANG Fei1,3,*
(1. Luohe Key Laboratory of Medical Bioengineering, Luohe Medical College, Luohe 462002, China; 2. Department of Basic Medicine, Luohe Medical College, Luohe 462002, China; 3. Department of Food Science and Human Nutrition, Luohe Medical College, Luohe 462002, China)

A fungal strain producing blue pigment, named F10, was isolated from a wild pine in southern Jiangxi, and it was identified as a member of the genus Pseudofusicoccum in the family Botryosphaeria by using ITS rDNA sequence homology comparison as well as morphological traits. We studied the stability of blue pigment when exposed to different solvents, pH values, temperatures illumination intensities, metal ions, oxidizers and reductants. The data showed that the pigment was sensitive to pH, metal ions, and reductants but not light, temperature or oxidants. We speculated that pH, metal ions, and reductants might change the structure of the pigment. Analysis of the basic chemical structure by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) and infrared spectroscopy (IR) revealed that the pigment was aromatic carboxylic acid compounds.

the genus Pseudofusicoccum in the family Botryosphaeria; blue pigment; properties

10.7506/spkx1002-6630-201712017

Q815

A

1002-6630（2017）12-0112-07

趙麗芳, 馬翠云, 羅海瀾, 等.1 株產藍色素真菌F10的ITS序列及其色素性質分析[J]. 食品科學, 2017, 38(12)： 112-118. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712017. http：//www.spkx.net.cn

ZHAO Lifang, MA Cuiyun, LUO Hailan, et al. Identification of a fungal strain F10 producing blue pigment and properties of the pigment[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 112-118. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201712017. http：//www.spkx.net.cn

2016-05-27

漯河醫學高等專科學校校級項目（2014-S-LMC14）

趙麗芳（1986—），女，講師，碩士，研究方向為分子生物學與天然產物的開發和應用。E-mail：zhaolifang0401@163.com

*通信作者：王飛（1972—），男，副教授，博士，研究方向為生物化學與天然產物開發。E-mail：whovering@yahoo.com