同源重組法構(gòu)建副干酪乳桿菌組氨酸蛋白激酶基因缺失突變株

岳元春，王 洋，由 田，高冬妮，平文祥，葛菁萍,*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

同源重組法構(gòu)建副干酪乳桿菌組氨酸蛋白激酶基因缺失突變株

岳元春1,2，王 洋1,2，由 田1,2，高冬妮1,2，平文祥1,2，葛菁萍1,2,*

（1.黑龍江大學生命科學學院，微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500）

構(gòu)建副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）組氨酸蛋白激酶prcK基因缺失突變株，為prcK基因功能研究提供實驗工具。采用同源重組技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒pKLKRT（含prcK：Tetr基因），將其電轉(zhuǎn)化進入L. paracasei HD1.7中，使prcK：Tetr基因同源重組到L. paracasei HD1.7的染色體上，通過四環(huán)素耐藥、氨芐青霉素敏感等特性篩選出含有prcK：Tetr基因的新L. paracasei HD1.7。結(jié)果表明，經(jīng)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證及酶切驗證后確定質(zhì)粒pKLKRT構(gòu)建成功，并成功轉(zhuǎn)化入L. paracasei HD1.7中，經(jīng)PCR確認L. paracasei HD1.7 prcK基因缺失突變株構(gòu)建成功。該突變株產(chǎn)生的細菌素效價比出發(fā)菌株低23.61%。采用同源重組方法成功構(gòu)建L. paracasei HD1.7 prcK基因缺失突變株，為研究L. paracasei HD1.7群體效應相關(guān)基因的分子機理奠定基礎(chǔ)。

副干酪乳桿菌；細菌素；組氨酸蛋白激酶基因；同源重組

乳酸菌常常與發(fā)酵食品及飲品聯(lián)系在一起[1-3]。本實驗所研究的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7是從乳酸酸菜發(fā)酵液中分離出的一株乳酸菌，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該菌株所產(chǎn)細菌素可以有效抑制多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和釀酒酵母[4-6]，而該細菌素的產(chǎn)生受一種被稱為三組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（three-component regulatory system，3CRS）的體系調(diào)控[7-9]。系統(tǒng)由3 個共轉(zhuǎn)錄基因組成，分別為被分泌至細胞外的細菌素類似物自誘導肽（autoinducer protein，AIP）和一個標準的細菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（two-component regulatory system，2CRS），系統(tǒng)由一個組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HPK）和一個反應調(diào)節(jié)因子（response regulator，RR）組成[10-11]，其中2CRS是細菌群體效應現(xiàn)象（quorum sense，QS）的調(diào)控系統(tǒng)。由田[12]從L. paracasei HD1.7中克隆到組氨酸蛋白激酶基因prcK，其無論在結(jié)構(gòu)還是功能上均與已探明功能的低GC含量革蘭氏陽性菌QS系統(tǒng)中的HPK家族中HPK10亞家族十分相似，相似性為99%，其蛋白產(chǎn)物為L. paracasei HD1.7群體效應系統(tǒng)中的HPK，負責調(diào)控細菌素的生成。

同源重組是任何一段具有同源序列的2個基因DNA之間的交換，涉及到參與重組的雙方染色體或DNA分子的斷裂和重接，在基因工程中已有廣泛的應用[13-20]。本研究利用同源重組的方法敲除prcK基因，試圖摸索一套完善的L. paracasei prcK基因缺失菌株的構(gòu)建方法，為研究L. paracasei群體效應相關(guān)基因的功能及分子機理奠定基礎(chǔ)，對于提高L. paracasei的應用領(lǐng)域及開展L. paracasei蛋白組研究也具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

L. paracasei HD1.7、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），以及質(zhì)粒pUC18（2 686 bp，Ampr）均由黑龍江大學微生物重點實驗室提供；質(zhì)粒pUC18-tet（4 086 bp，Tetr）由本實驗室自行構(gòu)建；克隆載體pMD18-T（2 692 bp，Ampr）購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、D-葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、亞硫酸鈉0.1 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、檸檬酸銨2 g，溶于800 mL ddH2O中，加入吐溫-801 mL，用濃硫酸調(diào)節(jié)pH 5.5，補足水至1 000 mL，115 ℃高壓滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：1 000 mL MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15～20 g，121 ℃高壓滅菌15 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，溶于800 mL ddH2O中，用10 mol/mL NaOH調(diào)pH值至7.0，補足水至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。

LB固體培養(yǎng)基：1 000 mL LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉12～15 g，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.3 試劑

Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNase A（DNase free）、限制性內(nèi)切酶、抗生素（氨芐青霉素、四環(huán)素） 大連寶生物工程有限公司；細菌基因組DNA（小量）抽提試劑盒、膠回收（小量）試劑盒、質(zhì)粒（小量）抽提試劑盒 上海華舜生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 引物

引物由大連寶生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物的設(shè)計Table1 Primer sequences used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

Air TECH超靜工作臺 蘇凈集團安泰公司；ABI9700聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 基因有限公司；Omega10凝膠成像分析系統(tǒng)美國Ultralum公司；TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-B11-420-S電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；DYY-Ⅲ-8B電泳儀 北京六一儀器廠；FE20 pH計 梅特勒-托利多公司；Gene Pulser X-cell電穿孔儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 prcK基因的克隆

參照GenBank中的L. paracasei E93490 prcK基因序列，利用軟件Primer 5.0設(shè)計一對引物：prcK-up/ prcK-down，模板L. paracasei HD1.7基因組用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取，PCR體系（50 μL）：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）10 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）4 μL、prcK-up（1 pmol/μL）10 μL、prcK-down（1 pmol/μL）10 μL、模板（25 ng/μL）10 μL、PrimeSTAR HS DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL、ddH2O 5.5 μL。PCR擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.2 prcK基因同源臂的克隆

根據(jù)prcK全基因序列設(shè)計兩對引物prcKL-up/prcKL-down和prcKR-up/prcKR-down，在prcKL-up和prcKL-down分別引入限制性酶切位點SacⅠ和KpnⅠ，prcKR-up和prcKR-down分別引入限制性酶切位點KpnⅠ和PstⅠ。以L. paracasei HD1.7基因組DNA為模板，使用上述2 對引物PCR擴增prcK基因的上游（L端）序列和下游（R端）序列。PCR體系同1.3.1節(jié)。PCR擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，62 ℃（L端）或55 ℃（R端）退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 prcK基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

從E. coli DH5α中提取質(zhì)粒pUC18，分別用限制性內(nèi)切酶SacⅠ及KpnⅠ酶切，并在T4連接酶的作用下與1.3.2節(jié)中擴增出的prcK基因L端序列（1.34 kb）連接，構(gòu)建載體pUC18-KL；隨后將載體pUC18-KL分別用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ及PstⅠ酶切，并與擴增出的prcK基因R端序列（1.37 kb）連接，構(gòu)建載體pUC18-KLKR；最后將質(zhì)粒pUC18-tet（Ampr，Tetr）及載體pUC18-KLKR用KpnⅠ酶切，并將酶切產(chǎn)物Tetr基因片段（1.4 kb）及pUC18-KLKR片段（5.3 kb）連接，獲得的prcK基因缺失質(zhì)粒，命名為pKLKRT。

1.3.4 電轉(zhuǎn)化

將上述5 μL基因缺失質(zhì)粒（0.3～0.5 μg）與40 μL L. paracasei HD1.7感受態(tài)細胞冰浴條件下混勻，然后將其加入到冰預冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，并于冰上放置10 min。使用電穿孔儀，設(shè)定各參數(shù)：電阻值200 Ω，電容值25 μF，點擊時間5 ms，電壓1.8 kV。電穿孔后迅速加入500 μL MRS培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管內(nèi)，30 ℃條件下溫育3 h。取100 μL涂布于相應的抗生素篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)72 h，使基因缺失質(zhì)粒與細菌染色體同源重組。

1.3.5 同源重組轉(zhuǎn)化子的檢測

根據(jù)1.3.1節(jié)的方法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，用引物對prcKL-up/prcKR-down和Tet-up/Tet-down檢測轉(zhuǎn)化子，同時，用出發(fā)菌株基因組作對照。

prcKL-up/prcKR-down引物對PCR體系、擴增條件同1.3.1節(jié)；Tet-up/Tet-down引物對PCR體系同1.3.1節(jié)，PCR擴增條件為：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，46 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.6 L. paracasei HD1.7 prcK基因缺失突變株發(fā)酵液抑菌效果檢測

對突變株和出發(fā)菌株L. paracasei HD1.7（對照）進行發(fā)酵，做抑菌實驗，指示菌選B. subtilis。然后對比突變株和出發(fā)菌株發(fā)酵上清液對指示菌的抑制程度，具體方法見參考文獻[21-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 prcK基因的克隆

按1.3.1節(jié)所述進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒進行回收，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見PCR產(chǎn)物大小與預期大小1.3 kb相符（圖略）。將PCR產(chǎn)物連入載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α感受態(tài)細胞后，進行藍白斑篩選。重組克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后進行測序。測序結(jié)果與GenBank上公布的序列進行相似性比較，相似性達99%，可以確定L. paracasei HD1.7基因組上存在prcK基因。

2.2 prcK基因同源臂的克隆

按1.3.2節(jié)所述擴增prcK靶基因的同源臂L端和R端，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒進行回收，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物L端和R端均與預期大小1.34 kb和1.37 kb相符，如圖1、2所示。將L端和R端均連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α感受態(tài)細胞后，進行藍白斑篩選。L端重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和SacⅠ和KpnⅠ的雙酶切鑒定后證實克隆成功；R端重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定和KpnⅠ和PstⅠ的雙酶切鑒定后證實克隆成功。

圖 11 pprrccKKLL--uupp//pprrccKKL-down引物對PCR結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification with prcKL-up and prcKL-down primers

圖2 2 prcKprcKR-up/R-up/prcKprcKR-down引物對PCR結(jié)果PCRFig.2 Results of PCR amplification with prcKR-up and prcKR-down primers

2.3 prcK基因缺失質(zhì)粒的構(gòu)建

將質(zhì)粒pUC18-tet（Ampr、Tetr）及重組質(zhì)粒pUC18-KLKR用KpnⅠ酶切，并將酶切產(chǎn)物Tetr片段（1.4 kb）及pUC18-KLKR（5.3 kb）線性片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，四環(huán)素、氨芐青霉素抗性平板篩選。

圖3 自殺質(zhì)粒PCR擴增Tetr基因結(jié)果Fig.3 PCR identification of recombination plasmid

對得到的陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證和酶切驗證。PCR驗證：以菌液為模板，Tet-up/Tet-down為引物，進行PCR反應，1～5泳道均在1.4 kb處有清晰條帶，與Tetr基因大小相符（圖3）；酶切驗證：用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ酶切pKLKRT質(zhì)粒，在第2、5泳道產(chǎn)生大小約為5.3 kb和 1.4 kb的2 個片段（圖4），大小分別與重組質(zhì)粒pUC18-KLKR和Tetr相符；用限制性內(nèi)切酶PstⅠ酶切pKLKRT質(zhì)粒，在第2、5泳道產(chǎn)生大小約為6.7 kb的單一條帶（圖5）。由圖5可知，1、3和4號菌株為假陽性，而2、5號為陽性轉(zhuǎn)化子。證明Tetr基因已經(jīng)重組到重組質(zhì)粒pUC18-KLKR上，重組質(zhì)粒pKLKRT構(gòu)建正確。

圖4 自殺質(zhì)粒KpnⅠ酶切驗證結(jié)果Fig.4 Identification of recombination plasmid with KpnⅠ digestion

圖5 自殺質(zhì)粒PstⅠ酶切驗證結(jié)果Fig.5 Identification of recombination plasmid with PstⅠ digestion

2.4 prcK基因缺失突變株的篩選與鑒定

在抗性平板中挑選出能在四環(huán)素（50 μg/mL）平板上生長而不能在氨芐青霉素（100 μg/mL）平板上生長的突變株，它是由導入其細胞內(nèi)的重組質(zhì)粒pKLKRT與其基因組DNA發(fā)生同源重組而產(chǎn)生的突變株，命名為“ΔK”。

圖6 6 TetTet-up/-up/TetTet-down引物對PCR驗證結(jié)果RFig.6 The results of PCR identification with Tet-up and Tet-down primers

圖7 7 prcKprcKL-up/L-up/prcKprcKR-down引物對PCR驗證結(jié)果Fig.7 PCR identification with prcKL-up and prcKR-down primers

以突變株基因組DNA為模板，出發(fā)菌株L. paracasei HD1.7為對照菌株，Tet-up/Tet-down為引物，進行PCR驗證，從突變株基因組DNA中擴增出與Tetr基因（1.4 kb）大小相同的片段，而不能從出發(fā)菌株中擴增出相同的片段（圖6）；同理以prcKL-up/prcKR-down為引物，進行PCR，以出發(fā)菌株基因組DNA為模板，擴增出的片段約2.7 kb，而以突變株基因組DNA為模板，擴增出的片段為L端、R端和Tetr基因的總和約4.1 kb（圖7）。PCR檢測證實轉(zhuǎn)化子Δ K為prcK基因缺失突變株。

綜上所述，重組質(zhì)粒pKLKRT與L. paracasei HD1.7基因組成功發(fā)生同源重組，即重組質(zhì)粒的兩個同源臂與L. paracasei HD1.7基因組發(fā)生雙交換，從而將Tetr基因插入基因組中，同時阻斷prcK基因，使其無法正確表達目的產(chǎn)物。

2.5 L. paracasei HD1.7 prcK基因缺失突變株發(fā)酵液抑菌效果

圖8 突變株和出發(fā)菌株對枯草芽孢桿菌的抑菌實驗Fig.8 Antibacterial efficacies of the original strain and prcK deletion mutant strain against B. subtilis

對突變株及出發(fā)菌株L. paracasei HD1.7（作對照）進行發(fā)酵，做抑菌實驗，指示菌選用B. subtilis，結(jié)果如圖8所示，prcK基因缺失突變株發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌的抑制程度比出發(fā)菌株的抑制程度弱，其產(chǎn)生的細菌素效價比出發(fā)菌株低23.61%，說明突變株所產(chǎn)生細菌素的量比出發(fā)菌株低。

3 討 論

自殺質(zhì)粒是進行基因敲除的有效工具，它的構(gòu)建必須符合一定的條件，如載體進入宿主細胞后不能自我復制，只有通過與宿主基因組發(fā)生同源重組，從而整合進入宿主基因組。同源重組現(xiàn)象在生物的進化過程中是較為常見的，但其發(fā)生的概率卻很低，其發(fā)生概率與同源序列長短息息相關(guān)[24-27]，在一定范圍內(nèi)同源序列的長度越長，發(fā)生概率越高，對于細菌而言，兩條同源臂長度超過200 bp就有發(fā)生同源重組的可能。Leloup等[28]研究了清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）中同源片段長度對同源單交換的影響，發(fā)現(xiàn)在同源片段長度0.3～1.2 kb范圍內(nèi)同源重組的效率呈對數(shù)增長，1.2 kb以后同源重組的效率增高不明顯，而且不同位置的DNA同源重組的效率不同。李昌瑜等[29]分別對SP12基因及SP20基因進行敲除，其一側(cè)同源重組片段長度分別為1 kb和600 bp，另一側(cè)同源重組片段長度差異不大，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP12基因同源重組率為50%，而SP20基因同源重組率為20%，可見同源重組片段任何一側(cè)片段的延長，均可導致同源重組效率的提高。

N a k a y a m a等[30]利用反向P C R技術(shù)克隆得到L. paracasei HD1.7擬群體效應相關(guān)基因prcK。本研究根據(jù)該文獻提供的基因序列設(shè)計一對引物克隆得到目的基因prcK，以窄宿主范圍的質(zhì)粒pUC18為骨架載體，利用可在G＋中表達的四環(huán)素抗性基因作為選擇標記，構(gòu)建L. paracasei HD1.7 prcK基因缺失質(zhì)粒pKLKRT。考慮到同源臂長短對同源重組發(fā)生概率的影響，本研究設(shè)計的自殺質(zhì)粒的同源臂是以目的基因及其兩翼序列為基礎(chǔ)，將標記基因插入2條同源臂中間，2條同源臂分別與其同源區(qū)域互換，這種同源臂的設(shè)計方式使得同源臂的長短可以較隨意的調(diào)整，有利于同源重組的發(fā)生，且可以自行設(shè)計合適的酶切位點供標記基因插入同源臂之間，提高同源重組發(fā)生的概率，有效增加基因缺失突變株構(gòu)建的可能。對L. paracasei HD1.7 prcK基因缺失突變株進行抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，其對B. subtilis的抑菌效果明顯小于出發(fā)菌株，細菌素效價比出發(fā)菌株降低23.61%，說明prcK基因的缺失對L. paracasei HD1.7細菌素的產(chǎn)生有一定的影響，其在L. paracasei HD1.7群體效應現(xiàn)象中扮演重要的角色。

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Construction of prcK Gene Deletion Mutant of Lactobacillus paracasei by Homologous Recombination

YUE Yuanchun1,2, WANG Yang1,2, YOU Tian1,2, GAO Dongni1,2, PING Wenxiang1,2, GE Jingping1,2,*
(1. Key Laboratory of Microbiology, Life Science College, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150500, China)

This study aimed to construct a histidine protein kinase gene (prcK) deletion mutant of Lactobacillus paracasei HD1.7 for providing an experiment tool for research on the function of the prcK gene. In this research, homologous recombination method was used. Plasmid pKLKRT (including prcK：Tetr) was constructed and used to transform L. paracasei HD1.7 by eletroporation. The prcK：Tetrin place of prcK was integrated into the chromosome of L. paracasei HD1.7 by homologous recombination. One strain that grew only on plates with tetracycline but not on plates with ampicillin was selected. The PCR amplification and endonuclease digestion analysis indicated that plasmid pKLKRT was successfully constructed and introduced into L. paracasei HD1.7. The prcK gene deletion mutant was confirmed by PCR amplification. In conclusion, a prcK gene deletion mutant of L. paracasei HD1.7 has been successfully constructed by homologous recombination, which will lay the basis for understanding the molecular mechanism of the quorum sensing-related genes in L. paracasei HD1.7.

Lactobacillus paracasei; bacteriocin; histidine protein kinase; homologous recombination

10.7506/spkx1002-6630-201712003

Q935

A

1002-6630（2017）12-0015-06

岳元春, 王洋, 由田, 等. 同源重組法構(gòu)建副干酪乳桿菌組氨酸蛋白激酶基因缺失突變株[J]. 食品科學, 2017, 38(12)：15-20.

10.7506/spkx1002-6630-201712003. http：//www.spkx.net.cn

YUE Yuanchun, WANG Yang, YOU Tian, et al. Construction of prcK gene deletion mutant of Lactobacillus paracasei by homologous recombination[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 15-20. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712003. http：//www.spkx.net.cn

2016-09-13

國家自然科學基金面上項目（31470537；31570492）；黑龍江省高等學校科技創(chuàng)新團隊（農(nóng)業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)）項目（2012td009）

岳元春（1991—），女，碩士，研究方向為微生物資源挖掘與利用。E-mail：yueyuanchungreat@163.com

*通信作者：葛菁萍（1972—），女，教授，博士，研究方向為微生物生態(tài)學及微生物遺傳育種。E-mail：gejingping@126.com