藥物安全性評價中豚鼠全身過敏試驗方法的研究

翁謝川，樊 星，王青秀，施 暢，李磊寧，歐陽兆和，孔 琦，王全軍，關勇彪，丁日高

（1.軍事醫學科學院基礎醫學研究所神經生物學研究室，北京 100850；2.軍事醫學科學院毒物藥物研究所，國家北京藥物安全評價中心，北京 100850）

藥物可能作為過敏原引發機體產生過敏反應。藥源性過敏反應對人體危害性大，且發病率高。常見的過敏癥狀包括皮疹、惡心、嘔吐、支氣管哮喘、變應性鼻炎，嚴重時可發生過敏性休克、心功能衰竭等，危及生命［1］。因此，評價藥物可能引起的過敏反應成為新藥臨床前安全性評價的一個重要內容。根據國家食品藥品監督管理局（State Food and Drug Administration，SFDA）于2005年頒發的《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》以及《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應）研究的技術指導原則》相關規定，局部給藥發揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）都需考察Ⅰ型過敏反應［2，3］。

在SFDA頒布的指導原則中考察Ⅰ型過敏反應最常見的方法為豚鼠（Guinea pig）全身主動過敏試驗（active systemic anaphylaxis，ASA）［2，3］。目前普遍認為，該方法具有操作相對簡單、敏感性好、結果穩定和可重復性高等特點［4-7］。但是，在藥物臨床前安全性評價工作中，特別是在操作和制定該過敏試驗具體方案時，一些可變的實驗設計因素，如不同的致敏劑量、激發劑量、激發時間、激發途徑和激發次數等，明顯影響著豚鼠全身過敏的發生，從而影響到臨床前藥物過敏性的評價結果。因此，為了解決這些重要的可變性的實驗設計因素對研究結果存在的影響，我們對其進行了研究。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級豚鼠，Dunkin Hartley品系，體重為300～400 g，由軍事醫學科學院動物中心提供，動物合格證號：SCXK（京）2006-0009；動物使用許可證號：SYXK（軍）2007-0008。飼養于國家北京藥物安全評價研究中心屏障設施內。對飼養的環境溫度、濕度和噪音進行嚴格控制，溫度控制在20℃±2℃，相對濕度（60±10）%左右，光照周期12 h∶12 h，光照時間為8∶00 AM～8∶00 PM，噪音在60 dB以下。另外，保持飼養環境中空氣流通，換氣次數達到（10～15）次/h。

1.2 試劑

氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司，生產批號：100705118；牛血清白蛋白，Roche公司，生產批號：738328。

1.3 方法

每組12只，雌雄各半。在實驗的第1、10和19天測量豚鼠體重，并對豚鼠的脫毛狀況進行觀察記錄。動物體重的測定時間在上午8∶00～9∶00期間進行，體重測量結束后再飼以食料。

實驗按照SFDA推薦的全身過敏實驗的程序和模式進行，分為3個階段（檢疫期、致敏期、激發期），即購進實驗動物稱完體重后，進行10 d的檢疫期。檢疫期后，挑選生理狀況合格的動物進行實驗隨機分組。分別在動物實驗的第1天（一次致敏組），第1、3、5天（3次致敏組）或者1、3、5、7、9天（5次致敏組）進行腹腔注射致敏；分別在實驗的第12、19、26天根據組別進行腹腔或者腿靜脈注射激發，激發劑量為致敏劑量2倍。實驗共分9組，第一組：生理鹽水對照組；第二組：10 mg/kg牛血清白蛋白組（腿靜脈注射激發）；第三組：50 mg/ kg牛血清白蛋白組（腿靜脈注射激發）；第四組：100 mg/kg牛血清白蛋白組（腿靜脈激發）；第五組：100 mg/kg牛血清白蛋白組（腹腔注射激發）；第六組：50 mg/kg牛血清白蛋白組（第12天經腿靜脈注射激發）；第七組：50 mg/kg牛血清白蛋白組（第26天經腿靜脈注射激發）；第八組：50 mg/ kg牛血清白蛋白經靜脈注射激發組（1次致敏）；第九組：50 mg/kg牛血清白蛋白經靜脈注射激發組（3次致敏）。按不同實驗因素進行實驗分組情況總結如表1。

1.4 過敏反應癥狀的觀察和嚴重程度分級

按照SFDA頒布的指導原則對過敏反應嚴重程度進行評級（見表2）。按照表3所示進行全身過敏反應強度的評價。

表1 按不同實驗因素進行實驗分組Tab.1 Various groups with different experimental factors

表2 過敏反應分級及癥狀Tab.2 Levels and symptoms of allergic reaction

1.4 統計學方法

應用統計學軟件SAS9.0非參數檢驗對實驗結果進行分析比較。實驗數據以均數±標準差（± s）表示。差異顯著性水平設為α=0.05。

2 結果

2.1 不同致敏劑量對豚鼠發生全身過敏反應的影響

生理鹽水組（Ⅰ組），10 mg/kg（Ⅱ組）、50 mg/ kg（Ⅲ組）和100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅳ組）豚鼠均經后腿靜脈注射激發。結果發現，生理鹽水對照組未發現明顯的過敏癥狀（激發劑量：2m l/kg）；第Ⅱ組（10 mg/kg牛血清白蛋白組）5只出現過敏反應弱陽性，5只出現過敏反應陽性，2只出現過敏反應強陽性；第Ⅲ組（50 mg/kg牛血清白蛋白組）1只出現過敏反應陽性，8只出現過敏反應強陽性，3只出現過敏反應極強陽性（死亡）；第Ⅳ組（100 mg/ kg牛血清白蛋白組）3只出現過敏反應強陽性，9只出現過敏反應極強陽性（死亡）。具體結果見表4。

表3 全身過敏反應癥狀等級評價標準Tab.3 Evaluation criteria on symptomsof systemic allergic reaction

2.2 不同激發給藥途徑對豚鼠發生全身過敏反應的影響

生理鹽水組（Ⅰ組）、100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅳ組）經豚鼠后腿靜脈注射激發，100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅴ組）經腹腔注射激發。結果發現，生理鹽水對照組12只豚鼠均未發現明顯的過敏癥狀（激發劑量：2 m L/kg）；第Ⅳ組3只出現過敏反應強陽性，9只出現過敏反應極強陽性（死亡），過敏反應的發生率為100％（12/12）；第Ⅴ組豚鼠6只出現過敏反應陰性，6只出現過敏反應弱陽性，0只出現過敏反應強陽性或者極強陽性，過敏反應的發生率為50％（6/12）。結果見表5。統計結果表明，相同劑量的情況下，靜脈激發給藥出現過敏反應的強度高于腹腔注射給藥（d f=2，χ2=29.59，P＜0.05）。

表4 不同組別豚鼠發生全身過敏反應癥狀等級評價情況Tab.4 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

表5 不同組別豚鼠發生全身過敏反應癥狀等級評價情況Tab.5 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

2.3 不同激發給藥時間對豚鼠發生全身過敏反應的影響

以生理鹽水組（Ⅰ組）為對照組，50 mg/kg牛血清白蛋白致敏的第Ⅲ組、第Ⅵ組和第Ⅶ組豚鼠分別于致敏期結束后的第3天、第10天和第17天經后腿靜脈注射激發。結果發現，第Ⅰ組12只豚鼠均未發現明顯的過敏癥狀（激發劑量：2 m L/kg）；Ⅲ組1只出現過敏反應陽性，8只出現過敏反應強陽性，3只出現過敏反應極強陽性（死亡）；Ⅵ組豚鼠1只出現過敏反應陰性，7只出現過敏反應陽性，4只出現過敏反應強陽性；Ⅶ組4只出現過敏反應陽性，5只出現過敏反應強陽性，2只出現過敏反應極強陽性（死亡）。結果見表6.統計結果提示，相同劑量和相同致敏激發途徑的情況下，第Ⅲ組和第Ⅶ組過敏反應發生的強度要高于第Ⅵ組（df=3，χ2=36.84，P＜0.05）。

2.4 不同致敏次數對豚鼠發生全身過敏反應的影響

生理鹽水組（Ⅰ組）作為陰性對照，觀察50 mg/kg牛血清白蛋白致敏次數不同時，即Ⅲ組5次、Ⅷ組1次和Ⅸ組3次，均經后腿靜脈注射激發時過敏反應發生的情況。結果發現，Ⅰ組12只豚鼠均未發現明顯的過敏癥狀（激發劑量：2 m L/kg）；Ⅲ組1只出現過敏反應陽性，8只出現過敏反應強陽性，3只出現過敏反應極強陽性（死亡）；Ⅷ組豚鼠4只出現過敏反應陰性，6只出現過敏反應陽性，2只出現過敏反應強陽性；Ⅸ組3只出現過敏反應陽性，8只出現過敏反應強陽性，1只出現過敏反應極強陽性（死亡）。結果見表7.統計結果提示，在相同劑量不同致敏次數的情況下，致敏3次（Ⅸ組）和5次（Ⅲ組）出現過敏反應的強度顯著高于1次致敏組（Ⅷ組）（df=3，χ2=39.91，P＜0.05）。

3 討論

免疫毒性是指外源性化合物對機體免疫系統的損傷作用，包括免疫抑制和免疫增強兩類。藥物引起的過敏反應（超敏反應或變態反應）、自身免疫反應以及不良免疫刺激等都屬于免疫系統反應性過度增強所導致的結果［1］。根據SFDA頒布的關于化學藥物、中藥和天然藥物臨床前免疫毒性評價的技術指導原則，豚鼠主動全身過敏反應所檢測的藥物毒性表現為藥物所致的Ⅰ型過敏反應，由IgE介導。該型過敏反應在新化合物中發生率高，在藥物的臨床副作用中比較常見。因此，采用敏感方法和如何評價新藥可能引起過敏反應應受到足夠的重視。

表6 不同組別豚鼠發生全身過敏反應癥狀等級評價情況Tab.6 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

表7 不同組別豚鼠發生全身過敏反應癥狀等級評價情況Tab.7 Level on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in four groups

通過比較生理鹽水對照組和不同劑量牛血清白蛋白組（10、50、100 mg/kg）豚鼠全身過敏反應發生的情況，我們發現過敏反應的發生率并沒有隨著劑量的增大而發生變化（均為100％），但是豚鼠過敏反應癥狀的嚴重程度卻存在明顯的差別（見表4），其中兩個高劑量組50、100 mg/kg發生反應的嚴重程度明顯高于10 mg/kg。該實驗結果提示，在新藥的安全性評價中，一定要注意受試藥物劑量的設計。劑量太低，雖然在一定范圍內，過敏反應發生率不變化，但很可能由于過敏反應輕微，而被忽視。另外，牛血清白蛋白作為最常見的受試物，如果用其在實驗方案的中作為陽性對照物，我們推薦的適宜劑量為50 mg/kg。主要考慮如果劑量過小，作為陽性對照難以觀察到明顯的過敏反應；劑量過大，容易致大量動物死亡，固然能證明實驗體系的正確性，但失去了與實驗組癥狀比較的意義。

根據指導原則，致敏過程可以采用靜脈、腹腔或皮下注射等方式，這些都是容易產生抗體的給藥方法。但是我們認為多次靜脈注射致敏可造成豚鼠不必要的傷害和疼痛，一般不應考慮。根據注射體積的差異，可以選擇腹腔和皮下致敏，由于腹腔致敏無明顯禁忌，一般可為首選。本研究發現，相同劑量和給藥周期的情況下，腹腔給藥大劑量激發時，豚鼠發生過敏反應的發生率和嚴重程度明顯降低，過敏反應很輕微，不易觀察，其原因可能為腹腔吸收較靜脈慢所致。因此，激發途徑應嚴格為快速靜脈內給藥。本研究還表明，激發給藥時間過短（第12天）和激發給藥時間過長（第26天），影響到了過敏反應發生率和發生強度，這與抗體IgE產生與消退的時間規律相關。因此激發時間在末次致敏后第10～14天，即檢疫期結束后第19～23天較為理想。本研究中關于致敏次數的結果表明，致敏次數過少（1次），不利于抗體的產生，過敏反應較弱；致敏次數太長，會影響到實驗操作成本并在致敏階段引起過敏反應，因此在藥物安全性評價中應以3～5次為宜。

在GLP條件下進行藥物安全性評價，使得影響豚鼠生理狀況的環境因素（如溫度、濕度、噪音、空氣等）和影響研究結果的實驗操作因素得到了有效的控制，這在很大程度上保障了實驗動物的質量和評價的有效性［4-7］。盡管如此，影響豚鼠主動全身過敏反應的一些非實驗因素以及操作環節仍可以影響到動物的質量和評價的結果。前期的研究中，我們對這些非實驗因素進行了系統的研究。本研究是此基礎上，進一步探討指導原則中過敏反應實驗設計方面的細節因素。研究結果表明，有必要遵照指導原則，注意實驗方案中的劑量設計、激發途徑、致敏次數和時間間隔，從而有效地評價藥物可能導致的I型過敏反應。

［1］霍艷，李波.藥物免疫毒性評價技術要求的國內外進展［J］.中國藥學雜志，2006，41（20）：1525-1529.

［2］國家食品藥品監督管理局.化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則［J］.2005，16-27.

［3］國家食品藥品監督管理局.中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應）研究的技術指導原則［J］.指導原則編號：GPT5-1.2005，1-20.

［4］葉有春.我國GLP建設與實施的幾點問題和建議［J］.安徽醫藥，2006，10（5）：388-389.

［5］翁謝川，丁日高，袁本利，關勇彪等.GLP條件下非實驗因素對實驗用豚鼠生理狀態的影響［J］.中國比較醫學雜志（中國實驗動物學雜志），2007，7：11-14.

［6］翁謝川，丁日高，袁本利等.實驗用豚鼠的生物學特性與飼養管理［J］.生物學通報，2007，42（1）：13-14.

［7］岑小波，趙瀛蘭，王莉等.從藥品技術審評的角度看GLP實施的必要性［J］.中國藥事，2005，19（7）：390-392.