間充質干細胞-透明質酸-多聚賴氨酸治療脊髓損傷的實驗研究

Raynald，李延濱，郭牧遙，黃 華，張 涵，于 昊，李海龍，崔福齋，安沂華

（1.首都醫科大學，北京市神經外科研究所，北京 100050；2.清華大學材料科學與工程系，北京 100084）

脊髓損傷是一種嚴重危害人類健康的中樞神經系統疾病，可導致感覺和運動功能喪失，目前對其后遺癥缺乏有效的治療手段。隨著干細胞及組織工程學技術的發展，細胞復合生物材料移植治療中樞神經系統損傷得到了更多的關注。本研究利用骨髓間充質干細胞作為種子細胞，透明質酸—多聚賴氨酸材料作為支架，研究其復合物對脊髓損傷的修復效果。

1 材料和方法

1.1 材料

Spraque Daw ley（SD）大鼠（中國醫學科學院實驗動物研究所SCXK（京）2009-0017）；細胞培養試劑：DMEM，10％牛血清（GIBCO Company）；手術器械：YZ20P5手術顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）；倒置顯微鏡（Nikon）；電鏡（Hitachi TEM system）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將5 mL已抗凝的人骨髓與等體積PBS混合，室溫下900 g離心10 min，沉淀物用PBS洗2次；細胞重懸，密度為4×107/mL；密度梯度離心法分離單個核細胞，重懸于DMEM（低糖）+ 15％胎牛血清培養基中，置于37℃、5％CO2的培養箱中培養；每3～4 d換一次培養基；細胞至90％融合時，0.25％胰酶/EDTA消化，傳代培養；

1.2.2 透明質酸-多聚賴氨酸（HA-PLL）材料的制備：HA在EDC（碳化二亞胺，1-（3-dimethylam inopropyl）-3-ethylcarbodiim ide）的介導下與PLL反應，避光過夜保存，溶液緩慢交聯成凝膠；將上述凝膠用去離子水在超聲波中清洗三次去除殘留物，-20℃冷凍后放入凍干機內進行冷凍干燥。48 h后得到多孔框架材料［1］。

1.2.3 實驗動物分組：體重200～220 g的雌性SD大鼠32只，隨機分為4組，單純損傷組（8只）、hBMSC移植組（8只）、HA-PLL移植組（8只）、hBMSC-HA-PLL移植組（8只）。

1.2.4 脊髓半橫斷模型的制作：水合氯醛（0.4 m L/100 g）腹腔注射麻醉。取俯臥位，無菌狀態下充分暴露T6-T7節段的脊髓，將其半橫斷，縱向去除脊髓組織的長度為2 mm，然后根據分組情況，將hBMSC、材料或hBMSC+材料植入脊髓缺損區域，逐層縫合。

1.2.5 大鼠運動功能的檢測：于術后8周內每周1次觀察大鼠運動功能恢復情況。評價方法參照BBB運動評分法［2］。

1.2.6 損傷部位形態學評價：術后8周殺死大鼠，利用電鏡觀察各組損傷局部是否有新生軸突和血管出現，并比較其形態差別。

1.2.7 統計學分析：大鼠運動功能的評分用平均值±標準差表示（±s），使用SPSS軟件進行重復測量方差分析，P＜0.05表示為有顯著性差異。

2 結果

2.1 動物行為學恢復情況

動物行為學變化主要是觀察損傷側下肢運動功能的恢復情況。觀察運動功能行為分為3個階段：早期主要觀察后肢關節的運動，中期主要觀察平衡能力與步態運動，晚期主要觀察下肢足部精細運動。8周內觀察可見，HA-PLL組大鼠的運動功能與單純損傷組相比評分差異無統計學意義，hBMSC移植組的運動功能恢復程度明顯好于上述兩組（P＜0.05），hBMSC-HA-PLL組的運動功能恢復程度則明顯好于單純損傷組及HA-PLL組（P＜0.05），但與hBMSC移植組相比差異無統計學意義（表1）。從恢復的時間段來看，在損傷后急性期改善程度較亞急性期顯著。4組中，hBMSC組及hBMSC-HAPLL移植組恢復的速度最快，尤其是在第一周時明顯高于對照組及HA-PLL組，兩周后對照組及HAPLL組也出現明顯的恢復，而hBMSC組及hBMSCHA-PLL組的恢復速度則有所減慢，但評分仍要好于對照組及HA-PLL組，而到5周以后各組的恢復程度幾乎沒有明顯變化（圖1）。

表1 表1 脊髓損傷術后1至8周BBB評分各組變化Tab.1 1st week to 8th week post-spinal cord injury each group BBB score

圖1 脊髓損傷術后1至8周BBB評分各組變化Fig.1 1st week to 8th week post-spinal cord injuryeach group BBB score

2.2 電鏡評價損傷局部形態

利用電鏡觀察新生軸突和血管生長情況。電鏡結果顯示：HA-PLL移植組和hBMSC-HA-PLL移植組，在有材料存在的脊髓損傷區域，可見新生神經纖維，包括有髓纖維和無髓纖維，其中大部分的新生神經纖維有施萬細胞圍繞（彩插2圖2），與HA-PLL組相比，hBMSC-HA-PLL組新生軸突的數量要更多，軸突的髓鞘形態較為完整，板層明暗相間，結構清晰，軸漿內細胞器豐富，且未見明顯髓鞘變性，兩組的材料內部都偶見新生血管形成，血管形態基本正常，血管內皮細胞生長良好（彩插2圖3）。單純損傷組的損傷區域主要被膠原和纖維細胞填充，偶見有孤立的新生軸突生成，但生長欠佳，而在有材料植入的損傷區域膠原及纖維細胞明顯減少。在單純細胞移植組，損傷局部也有新生神經纖維生成，新生軸突的髓鞘也較完整，但與HA-PLL移植組及hBMSC-HA-PLL移植組相比，其膠原及纖維細胞的成分更多，膠質瘢痕的生成更為豐富，但少于單純損傷組。

3 討論

脊髓損傷后，軸突的再生能力極為有限，因而此類患者往往遺留有嚴重的終生殘疾。如何有效促進此類患者損傷的中樞神經的再生，改善其神經功能，成為目前國際上的研究熱點。國內外許多研究證明，hBMSC在中樞神經系統損傷修復中具有巨大潛力。hBMSC具有干細胞多向分化和自我更新的潛能，且獲取途徑避免了相關倫理學爭議，體外擴增相對簡便且性質穩定，擁有更加廣闊的臨床應用前景。本研究選擇hBMSC作為種子細胞，結合組織工程學技術治療大鼠脊髓損傷。

脊髓損傷導致神經元及膠質細胞死亡、功能喪失以及膠質疤痕形成，膠質疤痕主要由反應性星形膠質細胞組成，可阻礙軸突再生和延伸［3，4］。上述改變在單純損傷組中有所體現。本研究采用多孔的HA-PLL水凝膠作為支架，希望其材質可有利于神經功能的恢復：其多孔的表面形態有利于細胞的貼附和生長。在有材料存在的組中可見：材料移植區損傷區域變窄，其內有新生軸突和血管，同時可見動物在行為學方面有所恢復［5-7］。上述結果說明，HA-PLL水凝膠在一定程度上可以減輕膠質瘢痕的形成，為軸突再生和移植細胞發揮作用提供相對良好的微環境，這與其他相關研究的結果基本一致。其機制可能包括：HA-PLL水凝膠的存在可以維持組織的形態結構；在細胞生長和物質交換方面起到重要作用，有利于損傷軸突的再生；同時材料本身的材質可以消除細胞周圍的水腫、誘導新生血管的形成，進一步促進軸突的再生［8-10］。

本研究結果顯示，有干細胞移植的兩組動物損傷恢復程度更好。BBB評分顯示脊髓損傷后急性期，hBMSC組和hBMSC-HA-PLL組評分顯著高于對照組和HA-PLL組，在亞急性期評分也略微高于后兩組。而8周時的BBB評分表明，HA-PLL組大鼠的運動功能與單純損傷組相比評分差異無統計學意義，而hBMSC移植組和hBMSC-HA-PLL組的運動功能恢復程度明顯好于沒有移植細胞的兩組（表1，P＜0.05）。已知hBMSC可分泌許多營養因子包括腦源性神經營養因子（BDNF）、神經營養因子-3 （NT-3）、血管內皮生長因子（VEGF）、神經生長因子（NGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、胰島素生長因子-1（IGF-1），等等。這些神經營養因子對神經系統的損傷修復發揮著重要作用。推測這些hBMSC分泌的細胞因子和細胞外基質促進了損傷軸突的再生、填充損傷區域并恢復脊髓的信號傳導、減輕膠質疤痕對軸突延伸的抑制效應，從而促進神經修復［3，4，11-14］。

雖然HA-PLL材料本身的確可以改善損傷微環境，有利于神經再生。但在本研究中，四組的BBB評分統計學分析表明，HA-PLL似乎對神經修復并無影響，推測有以下兩種可能：一是HA-PLL本身對神經修復的影響不如干細胞顯著；二是BBB評分對神經功能的評價不如神經電生理檢查敏感，雖然可以檢測出比較明顯的神經功能差異，但對不甚明顯的差異可能表現欠佳。這一點在我們隨后的實驗研究中已經得到初步證實（數據未顯示）。

綜上所述，聯合應用hBMSC-HA-PLL能夠促進大鼠運動功能的恢復，其具體機制仍需要進一步的深入研究。

［1］Tian WM，Hou SP，Ma J，et al.Hyaluronic acid-poly-D-lysinebased three-dimensional hydrogel for traumatic brain injury［J］.Tissue Engineering，2005，11：513-525.

［2］Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats［J］.Journal of Neurotrauma，1995，12：1-21.

［3］W illerth SM，Sakiyama-Elbert SE.Cell therapy for spinal cord regeneration［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60：263-276.

［4］Neuhuber B，Himes B，Shumsky JS，et al.Axon growth and recovery of function supported by human bone marrow stromal cells in the injured spinal cord exhibit donor variations［J］.Brain Research，2005，1035：73-85.

［5］Nair S，Remya NS，Remya S，et al.A biodegradable in situ injectable hydrogel based on citosan and oxidized hyaluronic acid for tissue engineering app lications［J］.Carbohydrate Polymers，2011，85：838-844.

［6］Romagnoli M，Belmontesi M.Hyaluronic acid-based fillers：theory and practice［J］.Clinics in Dermatology，2008，26：123 -159.

［7］Price RD，Berry MG，Navsaria HA.Hyaluronic acid：the scientific and clinical evidence［J］.Journal of Plastic，Reconstructive＆Aesthetic Surgery，2007，60：1110-1119.

［8］Lin CM，Lin JW，Chen YC，et al.Hyaluronic acid inhibits the glial scar formation after brain damage with tissue loss in rats［J］.Surgical Neurology，2009，72：50-54.

［9］Hou SP，Xu QY，Tian WM，et al.The repair of brain lesion by implantation of hyaluronic acid hydrogels modified with laminin［J］.Journal of Neuroscience Methods，2005，148：60-70.

［10］Ren YJ，Zou ZY，Cui FZ，et al.Hyaluronic Acid/Polylysine Hydrogel as a transfer system for transp lantation of neural stem cells［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2009，24：56-62.

［11］Hirabayashi TN，Kato K，Iwata H.Hyaluronic acid hydrogel loaded with genetically-engineered brain-derived neurotrophic factor as a neural cell carrier［J］.Biomaterials，2009，30：4581-4589.

［12］Schante CE，Zuber G，Herlin C，et al.Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical app lications［J］.Carbohydrate Polymers，2011，85：469-489.

［13］Chen X，Li Y，Wang L，et al.Ischemic ratbrain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production［J］.Neuropathology 2002，22：275-279.

［14］Chen X，Katakowski M，Li Y，et al.Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts：growth factor production［J］.Journal of Neuroscience Research，2002，69，687-691.