乳腺癌骨轉移骨硬化蛋白抗體的治療作用

祝孟海，李世飛，張樹東，姚 琦

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乳腺癌骨轉移骨硬化蛋白抗體的治療作用

祝孟海1，李世飛2，張樹東2，姚 琦1

目的 觀察用骨硬化蛋白抗體拮抗腫瘤細胞骨硬化蛋白(sclerostin)功能對乳腺癌MDA-MB-231 細胞骨轉移能力的影響。方法 骨硬化蛋白單鏈抗體(Sci-Ab)和MDA-MB-231細胞共培養，觀察細胞侵襲和遷移能力的改變。24只6～8周齡雌性裸鼠被隨機分為兩組, 每組12只,每只裸鼠分別以5×106個MDA-MB-231 細胞注射入左側股骨骨髓腔。對照組注射生理鹽水治療，實驗組給予骨硬化蛋白抗體(Sci-Ab)治療,35 d后行病理檢查, 比較兩組骨轉移發生率和骨腫瘤體積大小。取小鼠股骨，經micro-CT掃描并三維重構，觀察各組小鼠骨破壞情況。定量資料的比較采用t檢驗, 定性資料比較采用Fisher 確切概率檢驗。結果 MTT實驗和劃痕實驗表明，高濃度的Sci-Ab促進 MDA-MB-231增值和侵襲(P<0.05)。對照組有6 只發生骨轉移, 治療組有9只發生骨轉移。治療組的骨轉移發生率雖高于對照組, 但兩者差異無統計學意義(P=0.30)。對照組腫瘤平均體積為(0.87±0.244) cm3,治療組腫瘤平均體積為(0.73±0.118) cm3, 兩組間差異無統計學意義(P=0.35)。治療組的生存率高于對照組，有統計學差異(P<0.05)。Micro-CT分析表明，骨硬化蛋白抗體治療能夠阻止乳腺癌導致的骨損傷并且骨密度高于對照組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。結論 乳腺癌細胞致骨轉移能力與骨硬化蛋白表達水平密切相關, 抑制骨硬化蛋白表達可以提高乳腺癌細胞致骨轉移的能力,但是能夠提高乳腺癌骨轉移模型小鼠的生存率，生存率的提高可能與阻止乳腺癌骨轉移所介導的骨破壞相關。

乳腺腫瘤;骨轉移;骨硬化蛋白

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，且70%～80%可發生骨轉移[1-3]。一旦發生骨轉移，常常會引發一系列骨髓系統相關疾病，從而嚴重影響生活質量,降低生存時間[3-7]。乳腺癌骨轉移治療效果差，尋求新的治療靶點是治療該病的一個重大課題。

骨硬化蛋白是由骨細胞分泌通過阻斷WNT信號通路對成骨有抑制作用的蛋白，對維持骨穩定起關鍵作用[8, 9]。Wnt/β-catenin信號通路的過度激活和癌癥的發生發展有重要關系[10-12]。研究發現，在骨髓瘤患者中骨硬化蛋白水平增高并且升高的骨硬化蛋白通過抑制成骨過程，破壞了骨吸收與合成平衡[13, 14]。在乳腺癌各期，發生骨轉移過程中, 血清中骨硬化蛋白表達水平的升高和溶骨性骨破壞有密切關系。部分乳腺癌細胞株表達骨硬化蛋白已被證實, 但腫瘤細胞骨硬化蛋白的表達在骨轉移過程中的作用目前還不清楚。本研究利用骨硬化蛋白抗體[15](Sci-Ab)抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞株骨硬化蛋白的功能，研究對照組和治療組細胞的增殖、遷移和侵襲能力，以及通過構建乳腺癌骨轉移模型研究腫瘤細胞自身分泌的骨硬化蛋白在乳腺癌骨轉移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 人乳腺癌MDA-MB-231 細胞株購自北京協和醫院細胞庫。骨硬化蛋白抗體[16, 17](液體)，由中國科學院微生物研究所提供。H-DMEM高糖培養液、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清購自Hyclone公司，青霉素、鏈霉素由Sigma公司購買,1×PBS緩沖液和75%乙醇溶液，0.4%臺盼藍溶液。

1.2 動物 BALB/C-nu/nu雌性裸鼠24只,6～8周齡,體質量20～30 g，購自北京維通利華生物科技有限公司，動物于首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院動物實驗中心SPF條件下飼養, 保持恒溫(25～27 ℃)、恒濕(40%～50%), 每日以小鼠專用飼料飼養。將實驗裸鼠隨機分為兩組, 每組12只, 每只注射MDA-MB-231 細胞5×106至股骨骨髓腔內,1周后對照組給予生理鹽水治療，治療組給予骨硬化蛋白抗體(Sci-Ab)治療。

1.3 細胞培養 H-DMEM培養液(含10%胎牛血清)在37 ℃、5%CO2條件下培養MDA-MB-231細胞株, 每2 d或3 d更換培1次養液。待培養皿中細胞達80%左右時傳代。以0.25%胰蛋白酶消化對數生長期的MDA-MB-231細胞,室溫下以1000 r/min，離心5 min,用1×PBS液漂洗、反復吹打重懸MDA-MB-231。用0.4%臺盼藍溶液染色, 鏡下觀察,細胞計數。

1.4 MTT實驗 將處于對數生長期的MDA-MB-231細胞分成二組Sci-Ab(對照組加PBS溶液，實驗組加入等量PBS溶解的Sci-Ab 2 μg/ml)預治療24 h后經胰酶消化接種于96孔細胞板中,每孔接種200 μl,細胞濃度為5000/ml。然后放入CO2培養箱靜置培養。每孔對應加入Sci-Ab(照組加PBS溶液，實驗組加入等量PBS溶解的Sci-Ab 2 μg/ml)繼續孵育分別至1,2,3,4 d。細胞每24 h更換相同藥物濃度培養液。分別培養1,2,3,4 d后棄培養液,換成無血清的H-DMEM培養液,然后加入噻唑藍MTT 20 μl繼續37 ℃培養4 h,棄上清每孔加入DMSO 150 ml,室溫下振蕩15 min。酶標儀490 nm波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄實驗結果。

1.5 劃痕試驗 6孔板每孔接種不同濃度Sci-Ab(0、1、4 μg/ml)預治療24 h的50 000個細胞，待細胞匯合達到80%～90%時，用10 μl的槍頭劃痕，PBS洗3次，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基繼續培養，于0、24、48 h取出孔板，在同一觀察點處照相觀察劃痕愈合情況。比較各組細胞劃痕的愈合情況。

1.6 裸鼠股骨骨髓腔注射腫瘤細胞 以0.3 ml/mg的10%的水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠,75%乙醇消毒皮膚,裸鼠仰臥位,在膝蓋,髕韌帶和肌肉處做一切口縱向分裂暴露股骨遠端，多次反復吹打細胞懸液, 以100 μl的微量注射器吸取20 μl細胞懸液(細胞數為5×106/ml),于裸鼠股骨遠端進針, 緩慢且均勻地向骨髓腔注射細胞懸液，骨蠟封閉針孔，縫合肌腱、韌帶、傷口等。1周后對照組給予0.9%的生理鹽水治療，治療組給予骨硬化蛋白抗體(Sci-Ab)治療。

1.7 病理檢查 于腫瘤細胞注射后60 d處死裸鼠,肉眼觀察骨轉移腫瘤形成情況,如發生骨轉移, 則以10%多聚甲醛固定3 d后, 用10 %鹽酸脫鈣,然后乙醇脫水, 常規石蠟包埋, 制作切片, 行蘇木精-伊紅染色,在顯微鏡下觀察切片并判斷是否為骨轉移。對裸鼠股骨進行解剖, 測量骨腫瘤最長徑(a)和最短徑(b), 根據公式計算腫瘤體積:體積=a×b2/2。

1.8 Micro-CT分析 BALB/c磁性小鼠各12只，麻醉處死后切取股骨固定于無水乙醇中。采用小動物micro-CT(Inveon MM CT, SIEMENS，德國)進行掃描，掃描條件為：電壓60 kV，電流220 mA，濾片0.5，深度16 bit，曝光時間1500 ms，分辨率為8.99 μm，對同一標本獲得500張不同橫截面2048×3072像素的圖片。應用COBRA_Exxin三維重建處理軟件和Inveon Research Workplace分析軟件，小鼠的股骨掃描圖片進行三維圖像重建，選取2組小鼠重組圖像相同位置的股骨上端感興趣區域(region of interest，ROI)進行定量分析，組織骨密度(bone mineral density , BMD)以g/cm2表示。

1.9 統計學處理 應用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料的比較采用t檢驗或秩和檢驗, 計數資料比較采用Fisher 精確概率檢驗, 以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 骨硬化蛋白抗體對乳腺癌細胞增殖、侵襲能力的影響 MTT法繪制細胞生長曲線, 將實驗分為對照組和實驗組(對照組加PBS，實驗組加入等量PBS溶解的Sci-Ab 2 μg/ml)分別孵育1,2,3,4 d。根據生長曲線，高濃度的Sci-Ab促進 MDA-MB-231增值并且Sci-Ab作用不同組之間生長曲線有顯著性差異(P<0.05，圖1)。

劃痕試驗分析顯示，鋪種完細胞后1 d，當細胞匯合度達到80%～90%時，在3組細胞的板孔中間用10 μl槍頭劃一道適當寬度的傷痕，用PBS輕輕沖洗培養板后換用無血清培養基繼續培養。24 h、48 h后，高濃度的Sci-Ab可促使劃痕面積減少，愈合率高于未治療組(圖2)。Sci-Ab可以誘導MDA-MB-231細胞遷移。

圖1 不同Sci-Ab對MDA-MB-231細胞生長情況

2.2 病理檢查結果 對照組共有6只裸鼠出現骨轉移,平均體積為(0.87±0.244) cm3;治療組共有9只裸鼠出現骨轉移,平均體積為(0.73±0.118) cm3。治療組骨轉移發生率高于對照組而腫瘤體積低于對照組, 但兩者差異并無統計學意義(P=0.30，P=0.35，圖3A)。

圖2 劃痕試驗結果

A1,A2,A3分別表示對照組0 h,24 h和48 h細胞生長情況，B1,B2,B3分別表示Sci-Ab濃度為1 μg/ml細胞生長，C1,C2,C3分別表示Sci-Ab濃度為4 μg/ml細胞生長

根據兩組小鼠的生存曲線，治療組的生存率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05,圖3B)。

圖3 Sci-Ab治療對小鼠腫瘤體積和生存率的影響

A.對照組和Sci-Ab治療組小鼠骨腫瘤的體積；B.對照組和治療組小鼠的生存率曲線

2.3 骨轉移病理檢查 大體解剖肉眼觀察骨轉移腫瘤呈團塊狀突出骨質表面, 顏色呈灰白色(圖4A,B,C)。顯微鏡下觀察可見腫瘤細胞排列紊亂,形態不規則, 細胞分化差, 細胞核大，形態不一、染色較深,腫瘤細胞有侵潤周圍組織表現(圖5)。

圖4 腫瘤標本及腫瘤組織

A.對照組小鼠成瘤大體圖像，B.為實驗組成瘤圖像；C.上側為對照組腫瘤標本，下側為實驗組腫瘤標本

圖5 小鼠骨腫瘤(HE染色，×40)

2.4 小鼠股骨的micro-CT 分析結果 Micro-CT的分析結果表明，Sci-Ab組骨皮質完整，光滑，而對照組骨破壞嚴重，多數部分受到侵蝕，多出凸起，骨皮質斷裂(圖6)。此外，實驗組股骨骨小梁較為均勻、形狀規則、排列較為整齊有序；對照組股骨骨小梁增寬、數目減少排列紊亂而不規則，網狀結構明細減少甚至消失，骨的邊緣處可見不同程度的突起的骨贅形成。通過micro-CT 分析，Sci-Ab治療組小鼠的骨密度明顯高于對照組，差異有統計學意義(圖7，P<0.05)。

圖6 小鼠股骨的 micro-CT 三維重建圖像

圖7 兩組小鼠骨密度比較

3 討 論

乳腺癌患者一旦發生骨轉移, 常常引發一系列骨髓相關疾病, 導致患者生存率明顯降低[18]。但迄今為止乳腺癌骨轉移機制仍未完全闡明, 嚴重影響對乳腺癌骨轉移預防和治療。本研究表明抑制骨硬化蛋白可以促進MDA-MB-231增值和侵襲，并且小鼠模型實驗提示，抑制骨硬化蛋白可以誘導骨轉移發生,但是一定程度上抑制了乳腺癌所介導的骨破壞，從而提高小鼠的生存率。

Colucci等[14]發現，骨髓瘤患者中骨硬化蛋白的水平升高，骨硬化蛋白可以通過抑制成骨介導骨破壞，并且進一步證明了，骨保護素的下調和NF-kB受體活化因子(receptor activator of NF-kappa B, RANK)的上調相關。最近對大量患者研究發現，多發性骨髓瘤患者中較高水平的骨硬化蛋白組的生存率明顯低于較低組[13]；在非小細胞肺癌患者中SOSTDC1明顯降低[19]，且SOSTDC1較高的患者有較好的臨床愈后。但是，對于骨硬化蛋白與乳腺癌骨轉移的關系未做深入研究。本研究通過MDA-MB-231細胞與骨硬化蛋白單克隆抗體共同培養，抑制細胞內骨硬化蛋白的功能，發現骨硬化蛋白降低后，乳腺癌細胞的增值和侵襲能力明顯增強。Khramtsov等[11]發現Wnt/β-catenin信號通路過度激活的乳腺癌患者愈后差。本研究發現，Sci-Ab使MDA-MB-231細胞增值和侵襲能力增強有可能與Sci-Ab激活Wnt/β-catenin信號通路有關。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在腫瘤的形成、發展中發揮重要作用[20, 21]。小鼠的體內實驗表明，經過骨硬化蛋白抗體治療組小鼠生存率明顯提高，也許和抗體拮抗骨硬化蛋白對骨的破壞相關。

Micro-CT通過X線掃描和三維重建技術，一次掃描同時測量骨微結構與骨密度等的多項參數[22-24]，在三維重建模型上得到更精確骨結構的數據，能夠更準確的對骨的質量作出評價。本研究發現，骨硬化蛋白抗體治療能夠阻止乳腺癌導致的骨損傷，提高骨密度。Eda等[24]發現，多發性骨髓瘤細胞分泌骨硬化蛋白，抑制成骨細胞的分化，Sci-Ab可以逆轉骨髓瘤導致的骨破壞。

總之，本研究表明，骨硬化蛋白抗體能夠拮抗乳腺癌細胞分泌骨硬化蛋白所致的骨代謝失衡，進而保護骨，降低小鼠的病死率，但是促進了MDA-MB-231細胞的增殖和侵襲，并且誘使小鼠發生骨轉移。骨硬化蛋白與乳腺癌骨轉移的作用機制有待進一步研究。骨硬化蛋白與Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤細胞的增值和遷移及骨的重塑過程中發揮的作用，有可能是一種新的治療乳腺癌骨轉移所致的骨疾病的方法。

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(2016-11-30收稿 2016-12-21修回)

(責任編輯 張 楠)

The role of sclerostin antibody in treatment of bone metastasis from breast cancer

ZHU Menghai1, LI Shifei2, ZHANG Shudong2,and YAO Qi1.
1.Peking University Ninth School of Clinical Medicine, 100038， China;2.Shijitan Hospital,Capital University of Medical Science,100038,China

Objective To investigate the impact of inhibiting the function of sclerostin by antibodies in tumor cells on MDA-MB-231 induced bone metastasis.Methods MDA-MB-231 cells were co-cultured with sclerostin antibody(Sci-Ab). Twenty-four female nude mice aged 6 -8 weeks were divided randomly into two groups (n=12).MDA-MB-231 cells (6×105) were injected into the bone marrow space. The mice were treated with normal saline (NS) and sclerostin antibody (Sci-Ab), respectively. Thirty-five days after the treatment, all the nude mice were subjected to pathological examination to determine bone metastasis.The bone remodelling activities were compared between PBS treatment group and antibody treatment group using micro-CT analysis. Student’s t-test was used for the comparison of quantitative data, and Fisher's exact test was used for the comparison of qualitative data.Results According to MTT assay and Wound Healing, higher Sci-Ab promoted the proliferation and invasion of MDA-MB-231 cells. There were six bone metastasis lesions detected in control group(treated with normal saline) , and nine in experimental group(treated with Sci-Ab) , but there was no statistically significant difference between the two groups(P=0.30) .The bone tumor volume of control group and experimental group was (0.87±0.244) cm3and (0.73±0.118) cm3, respectively (P=0.35) . The survival of experimental group was significantly longer than that of control group(P<0.05). Micro-CT analysis of the tumor-bearing mice indicated that Sci-Ab was effective in bone protection against breast cancer-induced bone destruction as the bone mineral density (BMD; g/cm2)was significantly increased(P<0.05).Conclusions Bone metastasis from breast cancer is closely correlated with the sclerostin expression level in tumor cells.Inhibiting the expression of sclerostin can promote proliferation and invasion of MDA-MB-231 cells in vitro and improve the survival of mice in vivo.

breast neoplasms; bone metastasis;sclerostin

北京市科學技術委員會基金(Z151100003915094)，中國醫師協會(編號：2015-A35)。

祝孟海，碩士研究生。

1.100038，北京大學第九臨床醫學院；2.100038 北京，首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院

姚 琦，E-mail: yaoqi_2016@163.com

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