肺腺癌EZH2蛋白的表達及其與表皮生長因子受體突變的關系

王玉欣，趙天淼，包 芳，韓艷華，孔麗麗，孫 梅

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肺腺癌EZH2蛋白的表達及其與表皮生長因子受體突變的關系

王玉欣1，趙天淼2，包 芳3，韓艷華4，孔麗麗5，孫 梅5

目的 分析肺腺癌中EZH2蛋白的表達，尋找更有效的肺腺癌治療方法和為降低表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制藥(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐藥性提供理論依據。方法 免疫組織化學染色方法檢測肺組織中EZH2蛋白表達情況，實時熒光PCR法檢測肺腺癌EGFR基因突變狀況。比較EZH2蛋白在腺癌、正常肺組織和肺良性病變組織中的表達差異，分析EZH2的表達與EGFR基因突變的相關性。結果 EZH2在腺癌組織中的表達率(84.00%)明顯高于正常肺組織(12.00%)和肺良性病變組織(11.11%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。腺癌中EZH2的表達程度與患者的性別、年齡無關；與腫瘤的大小，組織學亞型及T分期有關(P<0.05)；與EGFR基因突變無關。結論 EZH2可能參與肺腺癌的發生發展，其表達與EGFR基因突變無關，有可能成為肺腺癌治療的新靶點。

肺腺癌；EZH2；EGFR突變

肺癌已成為威脅人類健康的一種嚴重疾病，隨著環境污染的加重，肺癌的發病率還會繼續增加。80%以上的肺癌是非小細胞肺癌[1]，其中腺癌占大多數。由于診療技術的不斷提高，特別是靶向藥物的應用，如表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制藥(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)，肺癌患者的生存率已明顯提高[2]，但是這類藥物僅適用于EGFR突變敏感的患者，而且很快出現耐藥性，所以開發新的靶向藥物和克服EGFR-TKIs耐藥性成為目前肺癌研究的熱點。果蠅Zest基因增強子人類同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是一種組蛋白甲基轉移酶，可使組蛋白H3第27位賴氨酸殘基發生甲基化[3]，引起下游上百種基因表達的沉默[4]。它在多種腫瘤的發生發展中發揮著重要作用，有可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點。但EZH2在肺腺癌發生發展中的作用及其與EGFR基因突變關系的研究鮮見報道。

本實驗應用免疫組織化學染色方法檢測肺組織中EZH2蛋白表達情況，應用實時熒光PCR法檢測肺腺癌EGFR基因突變狀況，并分析肺腺癌中EZH2蛋白表達的意義及其與EGFR基因突變的關系，為研發新的靶向藥物和降低EGFR-TKIs耐藥性提供新的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 收集武警吉林總隊醫院和吉林大學二院2013-10至2015-10根治性手術切除肺腺癌標本50例。男21例，女29例。年齡35～79歲，平均59.36歲。腫瘤直徑0.5～7 cm，平均2.81 cm。其中貼壁樣生長為主型4例，腺泡樣為主型29例，實體性為主型11例，乳頭狀為主型2例，黏液腺癌4例。T1期16例，T2期33例，T3期1例。有淋巴結轉移者14例，無轉移者36例。正常肺組織為距癌腫3 cm以上的非癌組織。另取18例肺良性病變組織作為對照，其中支氣管擴張3例，肺結核4例，肺大皰5例，炎性病變6例。所有病例均經兩位病理醫師復診確認。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學染色 采用PV-9002兩步法，試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司。蠟塊常規切片脫蠟，枸櫞酸鹽溶液電磁爐加熱修復，H2O2阻斷，滴加EZH2抗體(CST公司，1∶150)，4 ℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染顯微鏡下觀察。PBS代替第一抗體作為陰性對照，用胎盤絨毛組織作為陽性對照。

1.2.2 染色結果判斷 染色結果以染色強度和陽性細胞百分比綜合計分作定性分析。染色強度分為：無色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕褐色3分。每例隨機觀察5個高倍視野(400×)，每個視野計數100個細胞。陰性為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。上述兩項分值相乘所得積進行評分，0～1分為陰性，2分以上為陽性。EZH2位于細胞核，呈棕黃色。

1.2.3 EGFR基因突變檢測 采用羅氏CobasEGFR等位基因突變特異性擴增實時熒光定量PCR法。試劑盒均購于羅氏生物技術有限公司，蠟塊切卷片5～7片放入EP管中，脫蠟烘干，按照CobasDNA樣品制備試劑盒說明書提取DNA，按照CobasEGFR基因突變檢測試劑盒說明書配制PCR反應體系，應用Cobasz480實時熒光定量PCR分析儀進行EGFR等位基因特異性擴增與檢測，將自動檢測出EGFR基因突變狀況和突變類型。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件，定性資料的組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，EZH2表達和EGFR突變的關系用Spearman相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EZH2在人正常肺組織、肺良性病變和肺腺癌中的表達 EZH2在腺癌組織中的表達明顯高于正常肺組織和肺良性病變，差異有統計學意義(P<0.05)，但在正常肺組織和肺良性病變組織中的表達無統計學差異(圖1，表1)。

圖1 EZH2蛋白在肺組織中的表達(免疫組織化學染色，200×)

A.正常肺組織；B.肺大皰；C.肺炎性病變；D.貼壁樣生長為主型；E.腺泡樣生長為主型；F.實體性生長為主型；G.乳頭狀生長為主型；H.黏液腺癌

表1 EZH2蛋白在人正常肺組織、肺良性病變和肺腺癌中的表達

2.2 EZH2蛋白在肺腺癌不同亞型中的表達 EZH2蛋白表達在肺腺癌不同亞型之間差異有統計學意義(P=0.007)，在貼壁型明顯低于腺泡型和實性型(P=0.014；P=0.009)，而腺泡型和實性型比較，差異無統計學意義，其他亞型之間比較也無統計學意義(圖1，表2)。

表2 EZH2蛋白在肺腺癌不同亞型中的表達

2.3 EZH2蛋白表達與腺癌部分臨床指標的關系 EZH2蛋白在肺腺癌中的表達與患者的性別、年齡無關，與腫瘤的大小及T分期有關，腫物越大，分期越高，EZH2陽性率越高(P<0.05)。但與有無淋巴結轉移無關，盡管在淋巴結轉移組的陽性率(92.86%)高于無淋巴結轉移組的陽性率(80.56%，表3)。

2.4 EZH2蛋白的表達與EGFR基因突變的相關性分析 50例腺癌組織中26例發生EGFR基因突變，突變率為52.00%，其中EZH2陽性組中21例突變，突變率為50.00%，EZH2陰性組中5例突變，突變率為62.50%，EGFR基因突變率在EZH2陰性組略高于EZH2陽性組，但是二者相比差異無統計學意義，EZH2的表達與EGFR基因突變無相關性。

2.5 EZH2蛋白的表達與EGFR基因突變類型的分析 EGFR基因突變中外顯子19突變率最高，其次是外顯子21的突變，二者占所有突變的84.61%。EZH2的表達與EGFR基因突變類型無相關性(表4)。

表3 EZH2蛋白表達與腺癌部分臨床指標的關系

表4 EZH2蛋白的表達與EGFR基因突變類型的分析

3 討 論

EGFR-TKIs通過抑制EGFR酪氨酸激酶的活性，進而阻斷EGFR介導的下游信號傳導，最終抑制腫瘤的增殖，浸潤和轉移[5]。該類藥物特異性高，不良反應小，能顯著延長患者的總生存期和無進展生存期[2]。然而這些藥物僅適用于EGFR突變敏感的患者，而且常會在服藥9個月后不可避免地出現繼發性耐藥，使肺癌患者的治療陷入了新的困境，所以尋找新的靶向藥物，降低患者EGFR-TKIs的耐藥性已成為研究的熱點。

果蠅Zest基因增強子人類同源物2(Enhancer of Zeste homolog 2，EZH2)屬于PcG(Polycomb Group)家族，是一種組蛋白賴氨酸甲基轉移酶，可催化組蛋白H3第27位賴氨酸殘基發生甲基化[3]，引起下游上百種基因表達的沉默[4],在多種腫瘤中過度表達，且與腫瘤的浸潤轉移及不良預后密切相關，因此EZH2被認為是一種癌基因。目前已有文獻[6,7]報道EZH2在肺癌中高表達，而在正常肺組織及肺良性病變組織中低表達或無表達。本實驗發現，EZH2在肺腺癌組織中的表達明顯高于正常肺組織和肺良性病變組織，而在正常肺組織和肺良性病變組織間無明顯差異。提示EZH2可能參與了肺腺癌的發生，可能是肺腺癌的驅動基因。Hu等[8]發現，腫瘤越大，EZH2的表達率越高。Wan等[9]發現，EZH2的表達在小細胞癌明顯高于鱗癌和腺癌，且EZH2的表達與肺癌的TNM分期及淋巴結轉移相關，分期越高，有淋巴結轉移者EZH2表達率越高。說明EZH2參與腫瘤的發展和預后。本研究發現，肺腺癌中EZH2的表達與腫瘤的大小及T分期有關，但與淋巴結轉移無關，雖然EZH2蛋白在淋巴結轉移組中的表達率高于無淋巴結轉移組，但差異無統計學意義，這可能與研究對象個體差異及樣本量較少有關。另外，本實驗首次對肺腺癌不同亞型間EZH2蛋白的表達進行研究，結果發現EZH2蛋白表達在貼壁型明顯低于腺泡型和實性型，而腺泡型和實性型相比無統計學差異，其他亞型之間比較均無統計學差異。說明EZH2蛋白的表達在肺腺癌不同亞型之間存在一定差異。上述結果提示EZH2高表達與肺腺癌的惡性演變及侵襲生長有關。

有研究報道，EZH2表達在鉑類化療藥的敏感組中明顯低于耐藥組[10]，在EGFR突變組明顯低于未突變組[11]，當抑制EZH2的表達后，癌細胞的增殖和侵襲能力下降[12,13]，凋亡增強[14,15]，對順鉑的敏感性增強[10]，同時EGFR突變患者對拓撲異構酶Ⅱ(TOPII)抑制藥的敏感性增強[16]。本實驗結果顯示，EZH2表達與EGFR基因突變狀況無關，與EGFR基因突變類型亦無關。雖然EZH2表達在EGFR突變組低于未突變組，但差異無統計學意義，這可能與樣本量少有關。

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(2017-02-20收稿 2017-03-22修回)

(責任編輯 尤偉杰)

Relationships between EZH2 expression and EGFR mutation in lung adenocarcinoma

WANG Yuxin1, ZHAO Tianmiao2，BAO Fang3，HAN Yanhua4，KONG Lili5，and SUN Mei5.
1.Department of Pathology, 2.Department of Facilities，3. Department of Military Healthcare，Jilin Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Changchun 130052,China;4. Training Base of Jilin Provincial Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Changchun 130032,China;5.Department of Pathology, Second Hospital of Jilin University, Changchun 130042,China

Objective To explore the expression of EZH2 in lung adenocarcinoma and its associations with EGFR mutation.Methods Immunohistochemistry was used to examine the expression of EZH2 while EGFR mutation was detected with real-time fluorescence PCR.Results The expression of EZH2 in lung adenocarcinom(84.00%) was significantly higher than in normal lung tissues(12.00%) and in benign lung disease(11.11%) (P<0.05). EZH2 expression was related to tumor size, histological subtypes of adenocarcinoma and T stage(P<0.05), but not to EGFR mutation.Conclusion EZH2 may be involved in lung oncogenesis and development. The expression of EZH2 is not linked to EGFR mutation. It can be a new target for the treatment of lung adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma；EZH2；EGFR mutation

吉林省直衛生專項項目(編號：3D5153523429)

王玉欣，本科學歷，主治醫師。

130052 長春，武警吉林總隊醫院：1.病理科，2.器械科,3.軍療科； 4.130032 長春，武警吉林總隊后勤訓練保障基地衛生隊；5.130042 長春,吉林大學二院病理科

孫 梅，E-mail:sun.mei55@yahoo.com

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