蛋白激發子Hrip1互作蛋白的篩選及其原核表達

李書鵬 楊秀芬 袁京京 邱德文

（中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100081）

蛋白激發子Hrip1互作蛋白的篩選及其原核表達

李書鵬 楊秀芬 袁京京 邱德文

（中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100081）

蛋白激發子Hrip1是從極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）中分離純化出的一種新型超敏反應誘導蛋白，能激發煙草、擬南芥和水稻等多種植物的免疫防御反應，提高廣譜抗病性。為了探究Hrip1誘導植物抗性反應的分子機制，以Hrip1為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交，在水稻cDNA文庫中篩選Hrip1的互作蛋白。經回轉驗證和x-a-gal染色得到了一個Hrip1互作蛋白-CSN5。構建了互作蛋白CSN5的原核表達載體pGEX-6P-2-CSN5，并轉化大腸桿菌表達菌株BL21。經IPTG誘導后獲得了可溶性的融合表達蛋白，用GST親和層析柱純化獲得單一條帶的融合表達蛋白，并用Western blot鑒定了融合表達蛋白的正確性。研究結果為進一步鑒定Hrip1的互作蛋白及其功能奠定了基礎。

蛋白激發子；互作蛋白；酵母雙雜交；原核表達

蛋白激發子是一類能激發植物獲得性抗性，增強植物自身免疫的蛋白質，在植物保護上發揮著重要作用［1-4］。激發子誘導植物產生抗性的過程主要包括植物受體對激發子的識別、信號傳導，以及下游抗性相關基因表達調控等［5-7］。植物對激發子的識別是觸發植物免疫信號傳導的開關，候選互作蛋白的鑒定與功能研究將為深入了解植物與病原微生物的互作、揭示蛋白激發子誘導植物產生抗性的作用機制奠定堅實的基礎。目前，研究比較清楚的激發子受體僅有少數，如細菌鞭毛蛋白（Flagellin）flg22 的受體 FLS2（Flagellin-sensing 2），細菌轉錄延伸因子 Tu（EF-Tu）elf18 的受體 EFR，以及水稻上幾丁質受體等［8-11］。許多蛋白激發子與植物的互作蛋白尚未鑒定。

真菌蛋白激發子Hrip1（Hypersensitive response inducing protein 1），是本實驗室從極細鏈格孢菌中分離純化出了一種分子量為17 562.5 Da新型超敏反應誘導蛋白。利用快速擴增cDNA末端反應（RACE）克隆了Hrip1的編碼基因（GenBank accession number HQ713431）。Hrip1在煙草上引發了類似于典型超敏反應的壞死斑，DNA laddering在內的細胞凋亡反應，提高煙草對TMV的系統抗性；同時能誘導煙草中NO和ROS的產生，激活水楊酸途徑的蛋白激酶以及多種防御相關基因的表達［12］。Hrip1轉基因擬南芥對鹽和干旱脅迫的抗性顯著增強，說明蛋白激發子Hrip1基因在擬南芥中的表達能夠改善和提高植株的耐鹽抗旱能力［13］。此外，Hrip1能顯著提高水稻對稻瘟菌的抗性，誘導抗性基因和蛋白的上調表達（另文發表），為了闡述Hrip1誘導水稻的抗性機制，本研究利用酵母雙雜交篩選Hrip1在水稻中的互作蛋白，同時構建互作蛋白的原核表達體系，以期為研究水稻對蛋白激發子Hrip1的識別機制以及Hrip1互作蛋白的進一步鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

日本晴（Oryza sativa ssp. japonica）種子和原核表達載體pGEX-6P-2由本實驗室保存。水稻cDNA文庫、酵母菌株Mav203、酵母雙雜交載體pDBleu（BD）和pPC86（AD）由中國農業科學院植物保護研究所王國梁研究員惠贈。酵母Minimal SD Base、SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-His/-Trp/-Leu、x-a-gal等購自Clontech。大腸桿菌表達感受態細胞BL21、ProteinIso?GST Resin、Western blot Kit等購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 誘餌載體的構建 以本實驗室保存的pet32-Hrip1質粒為模板擴增Hrip1片段，用限制性內切酶Nco I和Not I對Hrip1片段和pDBleu載體（包含BD結構域）進行雙酶切，酶切產物回收，T4DNA連接酶25℃鏈接30 min，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1，涂布卡那霉素50 μg/mL 的LB平板，37℃過夜，挑取若干單克隆菌落，酶切驗證成功后送上海生工生物工程技術公司進行測序。

1.2.2 誘餌載體的轉化和自激活檢測

1.2.2.1 酵母感受態細胞的制備 從-80℃冰箱中取出酵母菌株MaV203，在YPAD平板上劃線培養，待酵母菌落直徑約為2-3 mm時，挑單克隆于1.5 mL離心管，30℃過夜，取100 μL菌液于50 mL的YPDA液體培養基中，30℃培養16-20 h至OD600=0.15，3 500 r/min 離心20 min，收集菌體，30 mL新鮮YPAD重懸細胞，繼續培養至OD600=0.6，3 500 r/min離心20 min，收集菌體，加入15 mL無菌水重懸細胞，繼續離心20 min，棄上清，加入1.5 mL 1.1×TE/ LiAc重懸細胞后12 000 r/min 離心30 s，棄上清，加入600 μL 1.1×TE/ LiAc，制成酵母感受態細胞。

1.2.2.2 質粒轉化酵母 在1.5 mL離心管中分別加入100 ng的質粒DNA、10 μL的carrierDNA、500 μL的PEG/ LiAc和50 μL的酵母感受態細胞，輕輕混勻；30℃培養30 min，加入50 μL的DMSO，42℃熱激25 min，12 000 ×g 離心10 s，棄上清，加入1 mL的YPD Plus Liquid Medium重懸細胞，30℃繼續培養1 h，12 000 ×g離心10 s，棄上清，用0.5 mL NacL（0.9%）溶液重懸細胞，取100 μL菌液涂在SD-Leu平板，30℃倒置培養，觀察酵母轉化子生長情況。

1.2.2.3 誘餌質粒自激活鑒定 將質粒pDBleu-Hrip、pPC86；pDBleu、pPC86分別共轉化酵母感受態細胞，取100 μL涂于 SD-Trp-Leu平板，30℃培養2 d，分別從SD-Trp-Leu平板上挑取包含pDBleu-Hrip、pPC86；pDBleu、pPC86的單菌落，1 mL SD-Trp-Leu過夜培養，取100 μL菌液，12 000 ×g離心10 s，棄上清，500 μL無菌水重懸細胞，重復該步驟2次，使菌液最終體積為200 μL，分別吸取1 μL菌液點在不同濃度3AT（0 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L、70 mmol/L、80 mmol/L） 的SD-Trp-Leu-His 平 板 上，30℃倒置培養3-5 d，觀察酵母菌落生長情況。

1.2.3 Hrip1水稻互作蛋白的篩選 制備包含有誘餌載體pDBleu-Hrip的酵母感受態細胞，在一個轉化組中加入將500 μL的酵母感受態細胞、1 μg的水稻cDNA文庫質粒、20 μL Yeast carrier DNA和1 mL PEG/ LiAc，轉化步驟同上，最終取若干400 μL菌液涂50 mmol/L 3AT 的SD-Trp-Leu-His平板，30℃倒置培養3-7 d。從篩庫平板上挑選生長速度快且菌落直徑較大的單菌落，3 mL SD-Trp-Leu液體培養基過夜培養，取200 μL菌液，用無菌水洗過后，重新點在50 mmol/L 3AT 的SD-Trp-Leu-His平板上，能生長的克隆為陽性候選克隆，用天根公司酵母質粒小提試劑盒提取質粒并送測序。測序結果在國際水稻庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中進行比對與分析。將感興趣的候選互作蛋白質粒與pDBleu-Hrip1重新共轉化酵母細胞，挑單菌落于SDTrp-Leu液體培養基，無菌水清洗細胞后，再次點50 mmol/L 3AT的SD-Trp-Leu-His平板和包含有x-agal（40 μg/mL）的50 mmol/L 3AT SD-Trp-Leu-His平板，能良好生長的為Hrip1互作蛋白。

1.2.4 Hrip1互作蛋白基因的克隆和原核表達載體的構建 取1 mg長勢良好的日本晴葉片，用天根植物總RNA試劑盒提取其總RNA，以RNA為模板，使用北京全式金公司生產的反轉錄試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）進行第一鏈 cDNA 的合成。根據數據庫中的互作蛋白基因序列設計特異序列，PCR擴增，反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性20 s，59℃復性20 s，72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸5 min。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測回收，連接pEASY-Blunt Zero載體，轉化全式金大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1，篩選單克隆送測序。以測序成功的pEASY-Blunt Zero-CSN5質粒為模板，設計特異引物，擴增互作蛋白CSN5基因序列，用限制性內切酶BamH I、Sal I對片段和原核表達載體pGEX-6P-2（GST標簽）雙酶切，產物膠回收，連接、轉化大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1，送測序。

1.2.5 互作蛋白的原核表達與純化 取測序正確的重組載體pGEX-6P-2-CSN5轉化大腸桿菌BL21感受態細胞。取菌落PCR檢測正確的菌株，接種50 mL氨芐青霉素的（終濃度為100 μg/mL）LB培養液中，37℃震蕩培養至OD600約0.6，調整溫度為37℃、28℃、16℃，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導過夜；收集菌體，超聲破碎后，分別取上清進行SDS-PAGE分析，確定合適的誘導溫度。取菌液接種到50 mL氨芐青霉素的LB培養液中，37℃過夜。按1∶100的稀釋比例轉接到1 L的LB培養液擴大培養，離心收集菌體，用上樣緩沖液（50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸菌體，超聲破碎后，12 000 ×g 離心1 h，收集上清后過0.45 μm濾膜，加入GST親和層析柱，孵育后，用洗脫緩沖液洗脫（50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，還原性谷胱甘肽GSH 20 mmol/L，pH 8.0），收集蛋白用3 KD超濾管除鹽，SDS-PAGE檢測分析。

1.2.6 互作蛋白的Western blot檢測 取純化后的蛋白樣品20 μL，同時取等量空載體菌株的純化產物作陰性對照，用12%的SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜（24 V×1 h），含5% 脫脂牛奶封閉液封閉2 h。取10 mL經稀釋的GST一抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育2 h，1×TBST buffer洗滌PVDF膜3次，每次5 min。加入10 mL稀釋的HRP二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，1×TBST buffer洗滌PVDF膜3次，每次5 min。PVDF膜瀝干后，置于專用塑料底層，加入顯色液檢測。

2 結果

2.1 誘餌載體的構建與鑒定

以pET32-Hrip1為模板擴增Hrip1基因，得到一條大小約450 bp的條帶（圖1-A），與預期相符。用Nco I和Not I雙酶切對Hrip1片段、pDBleu雙酶切，T4連接酶連接轉化感受態細胞Trans1-T1。37℃過夜，挑取若干單克隆菌落培養，提取重組質粒酶切檢測，結果（圖1 -B）得到一條500 bp和一條大于8 000 bp的條帶，說明Hrip1已經連接到載體pDBleu中。進一步的測序結果表明，目的片段按正確讀碼框插入pDBleu載體，沒有堿基的缺失和突變，成功構建誘餌載體pDBleu-Hrip。

2.2 誘餌載體的轉化和自激活檢測

將pDBleu-Hrip、pPC86；pDBleu、pPC86分 別共轉化酵母菌株MaV203，兩種轉化菌株都可以在SD-Trp-Leu平板上長出白色菌落，直徑大于2 mm，且含有誘餌蛋白的（pDBleu-Hrip、pPC86）菌株與對照組（pDBleu、pPC86）相比，長勢沒有差別。說明各載體成功轉化且誘餌載體對酵母菌株MaV203沒有毒性，可以進行后續實驗。用SD-Trp-Leu液體培養基分別培養包含誘餌蛋白的菌株（pDBleu-Hrip、pPC86）和對照菌株（pDBleu、pPC86），分別吸取1 μL菌液點在不同濃度3AT的SD-Trp-Leu-His 平板上，30℃倒置培養3-5 d。結果（圖2）發現，在3AT濃度為50 mmol/L時，包含誘餌蛋白的菌株和對照菌株都不能正常生長，說明50 mmol/L的3AT可以有效抑制MaV203細胞對報告基因的本底表達，因此可以利用3AT濃度為50 mmol/L的SD-Trp-Leu-His平板進行酵母雙雜交篩選。

2.3 Hrip1水稻互作蛋白的酵母雙雜交篩選

將水稻cDNA文庫轉化到包含誘餌載體pDBleu-Hrip的MaV203后， 在50 mmol/L 3AT 的SD-Trp-Leu-His平板篩選，得到182個初始陽性克隆，通過提取質粒、序列信息在Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中搜索比對，去掉移碼突變的菌株，得到16個陽性克隆。經重新共轉化，只有一個克隆可以在50 mmol/L 3AT SD-Trp-Leu-His上生長，同時在含x-agal（40 μg/mL）的篩選板上顯藍色（圖3）。說明篩選到一個水稻文庫蛋白與Hrip1存在相互作用。生物信息學分析表明，該互作蛋白在水稻庫中的名稱為COP9 signalosome complex subunit 5b（CSN5），基因cDNA全長1 083 bp，編碼360個氨基酸，分子量40 kD。

圖1 Hrip1基因的擴增和重組誘餌載體的雙酶切鑒定

圖2 誘餌載體的自激活檢測

2.4 Hrip1互作蛋白基因的克隆和原核表達載體的構建

以反轉錄得到的水稻cDNA為模板進行PCR擴增，獲得大小約為1 000 bp的目的條帶（圖4-A）。測序結果表明，目的條帶的序列與水稻庫中提供的序列完全一致，可以滿足構建表達載體的要求。用限制性內切酶BamH I、Sal I對CSN5片段和原核表達載體pGEX-6P-2（GST標簽）雙酶切，連接轉化后隨機選取若干單克隆，培養菌株后提取質粒，重組質粒雙酶切鑒定結果（圖4-B）顯示，在產物中得到一條大小1 000 bp左右的條帶，表明CSN5已經連接到pGEX-6P-2質粒中，進一步的測序結果顯示，重組載體的讀碼框正確，插入序列無堿基缺失或突變，表明成功構建了pGEX-6P-2-CSN5原核表達載體。

圖3 Hrip1與CSN5的酵母雙雜交互作

圖4 CSN5基因的擴增和重組表達載體的雙酶切鑒定

圖5 CSN5融合蛋白的誘導表達

2.5 互作蛋白CSN5的原核表達與純化

將重組表達載體pGEX-6P-2-CSN5轉化感受態細胞BL21，表達菌株分別在16℃、28℃和37℃下誘導過夜，收集菌體，超聲破碎，取適量上清液進行SDS-PAGE電泳，結果（圖5-A）顯示，在37℃和28℃下均不能檢測到融合蛋白的可溶性表達，只有當誘導溫度為16℃時，SDS-PAGE顯示出表達分子量67.8 kD的融合蛋白（CSN5蛋白的理論分子量為40 kD，pGEX-6P-2上的GST標簽分子量為27.8 kD），融合表達蛋白大小與預期一致。為了進一步明確CSN5融合蛋白的可溶性，重新收集16℃誘導的菌體，破碎離心后，分別取上清和沉淀進行電泳分析，以空載體菌株為陰性對照。結果（圖5-B）顯示，在陰性對照組中，上清和沉淀均沒有檢測到融合蛋白的表達。16℃誘導下，融合蛋白在沉淀和上清中均出現一條蛋白條帶，而且在沉淀中的表達量更多，說明融合蛋白以包涵體和可溶蛋白的形式表達。為了獲取純化的融合蛋白，將菌株接種到1 L的LB液體培養基集中大量培養，收集上清后用GST親和層析柱純化，SDS-PAGE顯示得到單一的蛋白條帶（圖6-A）。

2.6 互作蛋白的Western blot

為了進一步驗證純化得到的蛋白是GST-CSN5。使用抗GST標簽鼠單克隆抗體為一抗，辣根過氧化物酶HRP標記的羊抗鼠IgG（H+L）為二抗，Western blot檢測結果（圖6-B）表明，融合蛋白可以和GST標簽單克隆抗體結合，且目的條帶大小與融合蛋白分子量一致，說明GST-CSN5在大腸桿菌BL21中得到正確表達。

圖6 CSN5融合蛋白的純化和Western blot檢測

3 討論

植物在面對眾多潛在病原微生物時，依然可以頑強生存下去，這得益于能高效地識別這些微生物產生的激發子而激活其復雜而精密的先天免疫系統［14］。在植物與病原物相互作用中，植物細胞中的受體蛋白或靶蛋白起到了關鍵性作用。分布于細胞表面和細胞體內的靶蛋白或受體蛋白識別微生物入侵產生的PAMPs（Pathogen pathogen associated molecular patterns） 或 DAMPs（danger-associated molecular patterns）而啟動信號傳遞和下游多種防御反應［15］。

Hrip1是本實驗室分離到的一種蛋白質激發子，可以顯著提高煙草和水稻的抗性，但Hrip1引起植物抗性反應的免疫機理仍不清楚［12，13］。在本研究中，將Hrip1構建到包含BD結構域的誘餌載體pDBleu上，通過酵母雙雜交技術篩選水稻cDNA庫，得到了一個蛋白激發子Hrip1的互作蛋白CSN5。CSN5是COP9 信號復合體中（COP9 signalosome complex，CSN）的一個亞基。COP9 信號復合體由8個蛋白亞基組成CSN1-CSN8，最早發現于擬南芥的光形態構成的研究中［16，17］。擬南芥的COP9 突變體顯示出“組成型光形態建成”的表型，這類突變體在黑暗中生長時會像正常光照生長的幼苗一樣：下胚軸短小、子葉張開、質體分化以及光調控基因的表達。COP9復合體在高等真核生物中比較保守，主要參與蛋白的泛素化途徑［18］。它具有異肽酶的活性，負責將NEDD8（Neural precursor cell expressed，developmentally down-regulated 8）蛋白從cullin-RING泛素連接酶（CRLs）中去除；以保證CRLs功能的準確性［19，20］。后續研究證明，CSN廣泛參與了真核生物在生長發育中的各種代謝途徑，包括光形態構成、花的發育、激素信號轉導、細胞周期調控、DNA修復等［21］。CSN5本身是一種金屬蛋白酶［22］，是CSN的催化活性中心，通過包含的JAMM基序（JAB1/MPN/Mov34 metalloenzyme）將共價連接的RUB1（Related Ubiquitin 1）/NEDD8 切割開而行使其催化活性，。實際上，CSN同樣在植物的防御反應中發揮重要作用。在煙草中，CSN與SCF泛素連接酶在RAR1和SGT1的參與下，調控R基因介導的抗性反應，抵御多種病原物的入侵［23］。CSN5在擬南芥中可以和源自于阿拉伯半乳桿菌（Hyaloperonospora arabidopsidis，Hpa）以及丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae，Psy）的多種效應子直接互作，參與擬南芥對Hpa和Psy的抗性［24］。許多植物對病原物的響應和信號通路依賴于對特定蛋白質的降解，一些病原微生物將植物CSN作為靶標蛋白以阻止寄主的抵抗［21］。本研究通過酵母雙雜交篩選以及共轉試驗證明了蛋白激發子Hrip1能與CSN5相互作用，初步推測CSN5在Hrip1誘導植物免疫反應的過程中發揮著重要作用，植物有可能是在CSN5的參與下完成了對Hrip1的識別，同時啟動相應信號傳遞網絡，進而引起下游多種抗性反應，最終使植物具備了系統性獲得抗性，這些推測需要今后進一步研究證實。為了進一步驗證Hrip1和CSN5的體外互作，本研究建立了CSN5原核表達技術，選取帶GST標簽的pGEX-6P-2作為表達載體，從水稻cDNA文庫中準確克隆到CSN5基因，通過酶切、連接得到正確的pGEX-6P-2-CSN5重組表達質粒。將CSN5融合表達載體轉化大腸桿菌表達菌株BL21，分別在16℃、28℃和37℃下過夜誘導，發現只有16℃條件下，誘導表達可以得到可溶性性的目的蛋白。表達蛋白通過GST親和層析純化后，得到了單一條帶的目的蛋白。Western blot鑒定了原核表達的CSN5蛋白是正確的。本研究鑒定了蛋白激發子Hrip1在水稻中的互作蛋白，并建立了互作蛋白的原核表達技術，研究結果為后續體外驗證Hrip1和CSN5的相互作用以及CSN5基因的功能奠定了基礎。

4 結論

本研究通過酵母雙雜交技術，在水稻cDNA文庫中篩選到了蛋白激發子Hrip1的互作蛋白CSN5。構建互作蛋白CSN5的原核表達載體pGEX-6P-2-CSN5，并在大腸桿菌表達菌株BL21中成功表達，16℃過夜誘導，通過GST親和層析得到純化的可溶性融合蛋白。Western blot鑒定進一步證明了CSN5蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達。

［1］ Zhang Y, Yang X, Liu Q, et al. Purification of novel protein elicitor from Botrytis cinerea that induces disease resistance and drought tolerance in plants［J］. Microbiological Research, 2010, 165（2）：142-151.

［2］ Gómez-Gómez L, Felix G, Boller T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana［J］. The Plant Journal, 1999, 18（3）：277-284.

［3］ Mao J, Liu Q, Yang X, et al. Purification and expression of a protein elicitor from Alternaria tenuissima and elicitor-mediated defence responses in tobacco［J］. Annals of Applied Biology, 2010, 156（3）：411-420.

［4］ Bu B, Qiu D, Zeng H, et al. A fungal protein elicitor PevD1 induces Verticillium wilt resistance in cotton［J］. Plant Cell Reports, 2014, 33（3）：461-470.

［5］ Okinaka Y, Yang CH, Perna NT, et al. Microarray profiling of Erwinia chrysanthei 3937 genes that are regulated during plant infection［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 15（7）：619-629.

［6］ Garcia-Brugger A, Lamotte O, Vandelle E, et al. Early signaling events induced by elicitors of plant defenses［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2006, 19（7）：711-724.

［7］ Schwessinger B, Ronald PC. Plant innate immunity：perception of conserved microbial signatures［J］. Plant Biology, 2012, 63.

［8］ Boller T, Felix G. A renaissance of elicitors：perception of microbeassociated molecular patterns and danger signals by patternrecognition receptors［J］. Annual Review of Plant Biology, 2009, 60：379-406.

［9］ Zipfel C, Robatzek S, Navarro L, et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception［J］. Nature, 2004, 428（6984）：764-767.

［10］ Kunze G, Zipfel C, Robatzek S, et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants［J］. The Plant Cell, 2004, 16（12）：3496-3507.

［11］ Zhang XC, Wu X, Findley S, et al. Molecular evolution of lysin motif-type receptor-like kinases in plants［J］. Plant Physiology, 2007, 144（2）：623-636.

［12］ Kulye M, Liu H, Zhang Y, et al. Hrip1, a novel protein elicitor from necrotrophic fungus, Alternaria tenuissima, elicits cell death, expression of defence-related genes and systemic acquired resistance in tobacco［J］. Plant, Cell & Environment, 2012, 35（12）：2104-2120.

［13］ Peng XC, Qiu DW, Zeng HM, et al. Inducible and constitutive expression of an elicitor gene Hrip1 from Alternaria tenuissima enhances stress tolerance in Arabidopsis［J］. Transgenic Research, 2015, 24（1）：135-145.

［14］ Boller T, He SY. Innate immunity in plants：an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens［J］. Science, 2009, 324（5928）：742-744.

［15］ Dodds PN, Rathjen JP. Plant immunity：towards an integrated view of plant-pathogen interactions［J］. Nature Reviews Genetics,2010, 11（8）：539-548.

［16］ Kwok S F, Solano R, Tsuge T, et al. Arabidopsis homologs of a c-Jun coactivator are present both in monomeric form and in the COP9 complex, and their abundance is differentially affected by the pleiotropic cop/det/fus mutations［J］. The Plant Cell, 1998, 10（11）：1779-1790.

［17］ Wei N, Deng XW. COP9：a new genetic locus involved in lightregulated development and gene expression in Arabidopsis［J］. The Plant Cell, 1992, 4（12）：1507-1518.

［18］ Wei N, Serino G, Deng XW. The COP9 signalosome：more than a protease［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2008, 33（12）：592-600.

［19］ Schwechheimer C, Serino G, Callis J, et al. Interactions of the COP9 signalosome with the E3 ubiquitin ligase SCFTIR1 in mediating auxin response［J］. Science, 2001, 292（5520）：1379-1382.

［20］ Lyapina S, Cope G, Shevchenko A, et al. Promotion of NEDD8-CUL1 conjugate cleavage by COP9 signalosome［J］. Science, 2001, 292（5520）：1382-1385.

［21］ Franciosini A, Serino G, Deng XW. COP9 Signalosome Network［J］. Molecular Biology, 2014：313-332.

［22］ Cope GA, Suh GSB, Aravind L, et al. Role of predicted metalloprotease motif of Jab1/Csn5 in cleavage of Nedd8 from Cul1［J］. Science, 2002, 298（5593）：608-611.

［23］ Craig A, Ewan R, Mesmar J, et al. E3 ubiquitin ligases and plant innate immunity［J］. Journal of Experimental Botany, 2009, 60（4）：1123-1132.

［24］ Mukhtar MS, Carvunis AR, Dreze M, et al. Independently evolved virulence effectors converge onto hubs in a plant immune system network［J］. Science, 2011, 333（6042）：596-601.

（責任編輯 朱琳峰）

Screening of Interacting Proteins with Protein Elicitor Hrip1 and Its Prokaryotic Expression

LI Shu-peng YANG Xiu-fen YUAN Jing-jing QIU De-wen
（The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081）

The protein elicitor Hrip1 is a novel hypersensitive response-inducing protein secreted by necrotrophic fungus，Alternaria tenuissima，and it induces defense response and enhances broad-spectrum disease resistance in tobacco，Arabidopsis and rice plants. In order to investigate the molecular mechanism of Hrip1 inducing plant disease-resistance，we screened its interaction partners from a rice cDNA library using Hrip1 as bait protein and via yeast two hybrid system. After retransformation assay and x-a-gal staining，Hirp1-interacting protein CSN5 was obtained. Then，the recombinant pGEX-6P-2-CSN5 plasmid was constructed and transformed into the chemical competent cells of Escherichia coli BL21. The recombinant fusion protein in a single band was purified with a GST affinity chromatography column，and identified by Western blot. The results provided a base for further identification of the protein interacted with Hrip1 and its functions.

protein elicitor；interacting protein；yeast two hybrid system；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.20170001

2017-01-10

公益性行業（農業）科研專項（201403025）

李書鵬，男，碩士，研究方向：蛋白激發子與植物互作；E-mail：shupengli123@163.com

邱德文，男，博士，研究方向：植物誘導疫苗及生物防治；E-mail：qiudewen@caas.cn