梅花鹿胸腺素beta10基因真核表達載體的構建及鑒定

王佳雯 高云鵬 孫天霞 劉美辰 趙雨 王思明

（長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心，長春130117）

梅花鹿胸腺素beta10基因真核表達載體的構建及鑒定

王佳雯 高云鵬 孫天霞 劉美辰 趙雨 王思明

（長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心，長春130117）

轉錄組測序發現Tβ10在鹿茸中高表達，為了研究Tβ10與鹿茸生長發育間的關系，構建Tβ10真核表達載體。使用Trizol法提取梅花鹿鹿茸總RNA，PCR技術特異性擴增梅花鹿Tβ10基因，利用酶切位點將目的片段插入真核表達載體VR1012構建表達質粒，通過Fugene?6將質粒瞬時轉染到293T細胞中，使用Western blotting和免疫熒光方法檢測目的基因的表達。結果發現克隆得到的梅花鹿Tβ10基因長度為129bp，編碼42個氨基酸，成功構建真核表達載體VR1012- Tβ10-HA，轉染后使用Western blotting方法檢測到梅花鹿Tβ10在293T細胞中表達，免疫熒光方法證明梅花鹿Tβ10主要定位在細胞漿中。

梅花鹿；胸腺素beta10；質粒構建；轉染；真核表達

胸腺素（Thymosin）是一類在人類的健康和疾病中發揮不同重要作用的小分子蛋白。根據等電點的不同分為3個家族：胸腺素α（pI＜pH5.0），胸腺素β（pH5.0＜pI＜ph7.0），胸腺素γ（pI＞pH7.0）［1］。胸腺素β10是β族胸腺素中的一個重要成員，屬于Tβ4的一種類似物［2］，包括43個氨基酸殘基，具有兩個α螺旋結構。目前對Tβ10的研究集中于其在腫瘤［3-7］、胚胎［8］、神經發育系統［9］和炎癥細胞［10-12］中的差異表達，以及Tβ10在血管發生［13］、細胞生長和凋亡［14-16］方面的作用。同時，Tβ10被認為與細胞骨架結構有關，影響細胞形態、細胞增殖、運動型等［17-20］。本實驗室通過前期實驗結果，發現Tβ10在鹿茸快速生長期高度表達，說明Tβ10可能與鹿茸的生長和再生相關。通過構建梅花鹿Tβ10基因的真核表達載體，以期為研究其在鹿茸生長和再生中的作用機制提供有力的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體VR1012、E.coli DH5α菌株、鹿茸材料和293T細胞由本實驗室保存。TRIZOL和雙抗購自Invitrogen公司；pMD-18 T vector、反轉錄試劑盒、PCR相關試劑、限制性內切酶、DNA連接酶、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒等購自TaKaRa公司；轉染試劑Fugene?6購自Promega公司；鼠抗HA單克隆抗體和鼠抗Tubulin單克隆抗體購自covance公司；Alexa Fluor 488綠色熒光標記二抗購自Thermo Fisher公司；DAPI購自Roche公司；堿性磷酸酶標記的兔抗小鼠二抗購自Jackson公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；細胞爬片、6孔板購自Nest公司；其他生化試劑均為國產分析純或進口分裝試劑。PCR引物由長春華大中天生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 293T細胞培養于DMEM培養基，加入10%血清和1%雙抗，37℃，5% CO2條件下培養。待細胞生長至匯合度90%時傳代培養。

1.2.2 鹿茸cDNA的獲取 新鮮的梅花鹿茸取下后迅速放入液氮中，冷凍后置于液氮中研磨，0.05 g組織加入1 mL TRIZOL試劑，勻漿后室溫靜置10 min，加入0.3 mL 氯仿劇烈震蕩15 s，室溫靜置2-3 min，4℃條件下12 000 r/min離心20 min，上清加入1/5體積的5 mol/L NaCl混勻，再加入1/3體積的氯仿，震蕩15 s，靜置2 min，4℃條件下10 000 r/min離心15 min，上清加入1/2上清體積的混合液（0.8 mol/L檸檬酸鈉，1.2 mol/L NaCl）與1/2上清體積的異丙醇，震蕩后4℃放置90 min，4℃條件下10 000 r/min離心15 min，棄上清，75%的乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌1次，4℃條件下7 500 r/min離心5 min，棄上清，干燥15 min，DEPC水溶解沉淀RNA。使用逆轉錄酶以及Oligo（dt）進行逆轉錄PCR獲得cDNA。

1.2.3 Tβ10基因的PCR擴增和亞克隆載體構建 以轉錄組測序得到的序列設計引物，上游引物：5'-TCTAGAGCCACCATGGCAGACAAGC-3'（ 引 入Xba I酶切位點和kozak序列）下游引物：5'-GGATC CTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTTTG CTTGCTTC-3'（引入HA標簽和BamH I酶切位點）進行PCR擴增，程序為94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增30個循環，最后72℃延伸10 min。所得片段經膠回收后與pMD-18 T亞克隆載體16℃連接過夜。轉化感受態DH5α細胞，接種氨芐抗性的LB固體培養基，37℃過夜培養，挑取單克隆，提取質粒后進行酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.4 真核表達載體構建和鑒定 取測序正確的pMD-18 T-Tβ10-HA質粒和真核表達質粒VR1012分別進行Xba I和BamH I雙酶切，將目的片段和載體片段經膠回收后使用T4DNA連接酶16℃連接過夜，連接產物轉化感受態DH5α細胞，接種卡那抗性的LB固體培養基，37℃過夜培養，挑取單克隆，提取質粒后進行酶切鑒定。

1.2.5 VR1012-Tβ10-HA轉染293T細胞 在6孔細胞培養板中加入細胞爬片，再將胰酶消化后的293T細胞接種于細胞培養板。在5% CO2、37℃的細胞培養箱中生長至匯合度達到70%。使用Fugene?6轉染試劑將重組質粒VR1012-Tβ10-HA轉入293T細胞。

1.2.6 免疫印跡 轉染36-48 h后收集細胞，PBS沖洗1次除去殘留培養基，RIPA裂解緩沖液裂解細胞。加入上樣緩沖液混合并煮沸10 min致蛋白變性，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來分離樣品。通過半干轉儀將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜在5%的脫脂牛奶中在室溫封閉30 min，PBST溶液沖洗1次，加入含有一抗的1% PBS脫脂牛奶，室溫搖動孵育1-2 h或者4℃過夜，棄一抗，用PBST溶液漂洗3次，每次5 min。再加入混有對應二抗的1%PBS脫脂牛奶，室溫搖動孵育45 min。再用PBST溶液漂洗3次，PBS溶液漂洗1次，最后加入酶聯二抗的顯色底物，至特異性條帶清晰可見時，終止反應。

1.2.7 免疫熒光 293T細胞接種于放置有細胞爬片的24孔細胞培養板中，待細胞匯合度達到20%-50%時使用Fugene?6轉染試劑轉染VR1012-Tβ10-HA。24 h后棄上清，加入4%多聚甲醛溶液，室溫固定10 min。棄去固定液，用0.1%的Triton X-100室溫孵育8 min，用含有10% FBS的PBS溶液室溫封閉10 min。PBS溶液沖洗1次，加入一抗，室溫孵育1-2 h。棄去一抗，用PBST溶液沖洗3次。將對應二抗溶液加入孔板中，室溫孵育1 h。棄去二抗，用PBST沖洗3次。加入含有1 μg/mL DAPI的PBS溶液，孵育5 min后用PBS溶液沖洗1次。取出細胞爬片，細胞面沖下倒扣于載玻片上，使用熒光顯微鏡采集熒光圖像，分析蛋白的表達及細胞定位情況。

2 結果

2.1 Tβ10 cDNA的PCR擴增結果

從梅花鹿鹿茸組織中提取細胞總RNA，使用nano drop 2000測定OD260/OD280為1.9，通過瓊脂糖凝膠電泳可見3條清晰條帶，分別為28S、18S和5S（圖1，第1泳道），說明RNA無污染，純度較好。經RT-PCR技術獲取cDNA，以其為模板，根據轉錄組測序得到的序列設計引物，進行PCR反應。經瓊脂糖凝膠電泳以DNA Marker為對照，在100-250 bp左右可見一條特異性亮帶，與預期大小相符（圖1，第4泳道）。PCR產物經膠回收后，連接至亞克隆載體pMD-18 T（圖2，第3泳道）。質粒線性大小應為2 867 bp，但由于質粒的超螺旋結構，在電泳結果呈現出1 000-2 000 bp大小的條帶。連接后的重組質粒經Xba I和BamH I雙酶切鑒定，在2 000-3 000 bp和100-250 bp兩處可見特異性條帶（圖2，第4泳道），分別為pMD-18 T線性片段及Tβ10-HA片段。提示目的片段成功插入到pMD-18 T載體中。采用通用引物RV-M測序，結果證明插入片段無突變，構建成功。測序結果與轉錄組數據庫中序列匹配率為100%。

2.2 真核表達載體VR1012-Tβ10-HA雙酶切鑒定

取測序正確的重組質粒經雙酶切獲取目的片段，插入到真核表達載體VR1012中，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2）。質粒線性大小應為5 000 bp左右，但由于質粒的超螺旋結構，在電泳結果呈現出2 000-3 000 bp大小的條帶。經雙酶切鑒定，在5 000 bp和100-250 bp兩處可見特異性條帶，分別為VR1012線性片段及Tβ10-HA片段，證明VR1012-Tβ10-HA構建成功。

圖1 鹿茸軟骨細胞RNA提取以及Tβ10基因的PCR擴增結果

圖2 亞克隆載體pMD-18 T-Tβ10-HA和真核表達載體VR1012-Tβ10-HA的雙酶切鑒定

2.3 梅花鹿Tβ10基因及蛋白序列分析

分析梅花鹿Tβ10基因可知，其全長為129 bp，共編碼42個氨基酸。預測的與肌動蛋白結合的首要位點為18LKKTET23（圖3）。將梅花鹿Tβ10與人、牛、馬、小鼠、大鼠和豬等不同物種的Tβ10基因序列和氨基酸序列進行同源性比較，得出核苷酸同源性分別為86.7%、99.2%、86.7%、85.2%、85.2%和96.1%，蛋白同源性分別為86.4%、97.6%、86.4%、86.4%、86.4%和100%。說明在進化上梅花鹿Tβ10與牛和豬Tβ10較為接近。

圖3 梅花鹿Tβ10核酸和蛋白序列與其他物種的同源性比較

圖4 梅花鹿Tβ10在293T細胞中過表達的Western blot分析結果

2.4 Western blotting分析結果

轉染VR1012-Tβ10-HA質粒轉染293T細胞，48 h后收取細胞進行Western blotting分析，結果（圖4）表明，與轉染空載體VR1012的對照細胞樣品相比，轉染VR1012-Tβ10-HA的樣品在6 kD處可見一特異性條帶，說明梅花鹿Tβ10基因在293T細胞中得到了表達。

2.5 免疫熒光分析結果

通過熒光顯微鏡觀察可見，轉染重組質粒的細胞可見明顯的綠色熒光，說明梅花鹿Tβ10基因得到了表達。同時蛋白主要表達于細胞質中，細胞核內幾乎無表達。而未轉染的293T細胞和轉染空載體的陰性對照則未見綠色熒光。再次說明了梅花鹿Tβ10在293T細胞中得到了成功表達（圖5）。

3 討論

胸腺素β10是一種普遍存在于各種組織細胞當中的淋巴細胞生長因子，參與多種重要的生理和病理活動，一直是研究的熱點。鹿茸是目前發現的唯一可再生哺乳動物器官，鹿茸生長速度極快，最快時可以1-2 cm的速度迅速生長，最終可長至120 cm。鹿茸的快速生長和再生機制目前尚不明確。通過對鹿茸不同生長時期的轉錄組數據庫進行測序分析，發現Tβ10在快速生長期表達量上調，說明其可能與鹿茸的生長發育有一定關系。本研究通過構建梅花鹿Tβ10真核表達載體，為進一步研究其在鹿茸生長發育過程中的作用奠定了基礎。

由于鹿茸軟骨中存在較多蛋白，本研究采用改良的Trizol法來提取總RNA。該方法可除去絕大部分蛋白及多糖雜質，得到較為純凈的RNA。同時，本研究首次成功克隆得到了Tβ10的基因序列，與人、牛、馬、小鼠、大鼠和豬等不同物種的Tβ10基因序列和氨基酸序列進行同源性比較，得出核苷酸同源性分別為86.7%、99.2%、86.7%、85.2%、85.2%和96.1%，蛋白同源性分別為86.4%、97.6%、86.4%、86.4%、86.4%和100%。說明Tβ10在進化上非常保守，梅花鹿Tβ10的氨基酸序列與牛和豬Tβ10更為接近，與人、馬、大鼠和小鼠Tβ10的C端有一定差異，這是否會影響梅花鹿Tβ10的功能，是未來要研究的一個內容。

利用本實驗所構建的Tβ10真核表達質粒，可以通過瞬時轉染或穩定轉染軟骨細胞，研究Tβ10是否可以促進軟骨細胞生長，刺激軟骨細胞分化；同時可以利用本研究發現的Tβ10序列，構建原核表達質粒，獲得重組Tβ10蛋白，研究其對軟骨細胞增值的影響，從而深入探索Tβ10在鹿茸軟骨細胞快速增長過程中所起的作用。

圖5 梅花鹿Tβ10-HA在293T中過表達的免疫熒光檢測結果

4 結論

本研究從梅花鹿鹿茸中獲得了Tβ10的cDNA，通過Xba I和BamH I酶切位點連入VR1012真核表達質粒，成功構建梅花鹿Tβ10真核表達載體，使用Western blotting和免疫熒光技術驗證了其在293T細胞中的表達。

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（責任編輯 狄艷紅）

Construction and Identification of Recombinant Eukaryotic Plasmid of Sika Deer Thymosin Beta10

WANG Jia-wen GAO Yun-peng SUN Tian-xia LIU Mei-chen ZHAO Yu WANG Si-ming
（Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Research and Development Center，Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117）

Tβ10 was discovered to be highly expressed in sika antler in transcriptome sequencing. In order to study the relationship between Tβ10 and the growth and development of antler，the Tβ10 eukaryotic expression vector was constructed. Extracting the total RNA from sika deer antler by Trizol regent，the coding region of Tβ10 gene was amplified by RT-PCR，and then the gene fragment was inserted into the recombinant eukaryotic expression vector VR1012. The eukaryotic expression plasmids were transfected into 293T cells by Fugene 6 agent. The ORF of Tβ10 cDNA was 129 bp，encoding for a protein of 42 amino acids. The eukaryotic expression vector VR1012- Tβ10-HA was constructed successfully. The expression of sika deer Tβ10 was detected in 293T cells by Western blotting. Immunofluorescence demonstrated that the expressed fusion protein of the Tβ10 was located in the cytoplasm in 293T cells.

sika deer；thymosin beta10；plasmid construction；transfection；eukaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1000

2016-11-02

吉林省科技發展計劃（20140622003JC）

王佳雯，女，助理研究員，研究方向：中藥生物技術；E-mail：wangjiawen1229@163.com

王思明，男，實驗員，研究方向：中藥化學；E-mail：369257449@qq.com