白藜蘆醇對IgA大鼠腎組織TH2型炎性因子及血清CIC的影響

周敏

（江蘇食品藥品職業技術學院，淮安 223003）

白藜蘆醇對IgA大鼠腎組織TH2型炎性因子及血清CIC的影響

周敏

（江蘇食品藥品職業技術學院，淮安 223003）

旨在考察白藜蘆醇對IgA大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13三種TH2型炎性因子及血清循環免疫復合物（CIC）的影響。將10只正常大鼠作為正常組，另40只采用胎牛血清白蛋白（BGG）處理9周制備4組IgA腎?。↖gAN）大鼠模型，9周末進行白藜蘆醇給藥，并根據給藥劑量的不同分別定義為模型組（未給藥）、低劑量組（15 g生藥/kg）、中劑量組（30 g生藥/kg）、高劑量組（45 g生藥/kg），12周末剖殺，采用免疫熒光染色檢驗造模有效性，采用RT-PCR檢測腎組織IL-4、IL-5、IL-13表達水平，采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）測定血清CIC濃度。結果顯示，造模成功；與正常組比較，模型組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的相對表達水平極顯著增高（P＜0.001），與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的相對表達水平均依次降低，各細胞因子指標組間兩兩比較均有統計學意義（P＜0.01）；與正常組比較，模型組血清CIC濃度顯著升高（P＜0.01），低、中、高劑量組均高于正常組，但與正常組比較均無統計學意義（P＞0.05），與模型組比較均顯著更低（P＜0.05），并依次呈逐漸降低趨勢。白藜蘆醇可明顯下調IgA大鼠腎組織總促炎性因子IL-5的表達，炎性反應減弱后抗炎性因子IL-4與IL-13也隨之降低，同時白藜蘆醇也能顯著降低IgA大鼠血清CIC濃度。

白藜蘆醇；IgA腎?。籘H2型炎性因子；循環免疫復合物

IgA腎病（IgA nephropathy，IgAN）是一類以IgA在腎小球系膜區發生沉積為主要病理特征的腎小球疾病，其臨床表現比較多樣，相對以鏡下或肉眼血尿最為常見，同時可伴不同程度蛋白尿及腎功能受損等癥狀［1］。當前普遍認為，IgAN在全球范圍內居各種原發性腎小球腎炎發病的首位，而且在確診為IgAN的5-25年內，大概有30%左右的患者將不可逆地進展為終末期腎?。‥nd-stage renal disease，ESRD）［2，3］。IgA免疫系統發生異常是導致IgAN發病的重要因素［4］。其中輔助性T淋巴細胞（T-heleper lymphocyte，Th）的失調已被證實為產生致病性IgA1（IgA亞型之一）的關鍵性環節［5］。Th分泌的細胞因子主要包括Th1與Th2兩個亞群，目前大多數研究支持IgAN的發病及病情進展應與Th1/Th2平衡向Th2偏倚有關，而Th2所分泌的細胞因子則主要包括IL-4、IL-5及IL-13［6］。白藜蘆醇（Esveratrol）又名茋三酚（3，4'，5-三羥基二苯乙烯），是植物在諸如機械性損傷、遭受強紫外線照射以及真菌感染等不利條件下所產生的“植物補體”，其分子式為C14H12O3，相對分子量為228.25?，F代藥理學研究表明，白藜蘆醇具有包括抗炎在內的多種藥理作用［7］。本研究通過考察白藜蘆醇對IgA大鼠腎組織TH2型細胞因子及血清循環免疫復合物（Circulating immunocomplex，CIC）的影響，旨在為臨床應用白藜蘆醇治療IgAN提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD大鼠購自山東大學動物飼養中心；白藜蘆醇購自上海得恩德醫藥科技有限公司，純度95.0%；胎牛血清白蛋白（BGG）與羊抗大鼠IgA、IgG、IgM和C3購自美國Abcam公司；IL-4、IL-5、IL-13及β-actin mRAN內參購自康偉世紀公司；Olympus熒光顯微鏡購自上海賴氏電子科技有限公司；TRIzol購自美國invitroge公司；RT-PCR逆轉錄試劑盒購自Promega公司；基因擴增儀器購自（BIOER，Hangzhou Techology.co，China）；PCR引物由北京華大基因公司設計合成；凝膠電泳儀及成像系統購自Bio-RAD公司；CIC酶聯免疫吸附法試劑盒購自北京科盈美生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 清潔級SD大鼠50只，雌、雄各25只，7周齡，體質量180-220 g。隨機選取10只作為正常組，另40只為造模組。參考當前國內外最常使用的IgA大鼠造模方法進行造模，即應用抗原低于食管黏膜內皮細胞施加直接性刺激，繼而將巨噬細胞激活并最終獲得IgAN模型［8］。具體方法為：以0.9%氯化鈉注射液溶解BGG，配制成含BGG 0.1%的溶液給予造模組連續飲用8周，8周后再連續3 d采用尾靜脈注射方式追加BGG，1次/d，單次注射劑量1 mg；正常組依次分別給予等量0.9%氯化鈉注射液飲用及尾靜脈注射。于第9周末在造模組中任意選30只并隨機分為3組（每組各10只）進行白藜蘆醇ig給藥，各組給藥劑量分別為15 g生藥/kg（低劑量組）、30 g生藥/kg（中劑量組）及45 g生藥/kg（高劑量組），未給藥的10只大鼠定義為模型組。實驗期間所有大鼠除上述給藥方案外均正常飲食生活，蒸餾水喂養。

1.2.2 標本制作 所有大鼠于第12周末剖殺并取材。以50 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉后沿腹中線將腹部皮膚與腹肌剪開，將腸管推開并充分暴露腹主動脈后穿刺采血，以轉速3 000 r/min離心處理血液樣本，離心時間10 min，收集血清用于CIC濃度檢測。完成血液樣本采集后應立即再進行腎組織樣本采集，將腎周圍殘存結締組完全剝離后于距腎門1 mm處切取腎組織，然后置于-70℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 免疫熒光染色 采用直接法染色，取腎皮質冰凍切片3 μm，吹干后采用丙酮固定5 min，接著采用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，5 min/次，將采用羊抗大鼠免疫熒光IgA、IgM和C3（1∶10）稀釋熒光標記的抗體滴加至組織切片，在37℃溫度條件下孵育45 min，孵育結束后再采用PBS液洗3次，5 min/次，完成后用緩沖液甘油封片并采用Olympus20倍熒光顯微鏡鏡檢。鏡下熒光強度分5個強度梯度：（-）無熒光，（±）弱熒光且不清晰，（+）弱熒光清晰，（++）明亮熒光，（+++）強熒光。熒光越強則表示CIC沉積越嚴重。

1.2.4 腎組織IL-4、IL-5、IL-13的RT-PCR檢測將冰凍腎組織在研缽中碾碎，采用TRIzol一步法提取總RNA［9］。接著以所獲總RNA為模版，采用Promega公司試劑盒進行逆轉錄反應并得到相應的cDNA，在PCR儀上擴增。應用primer Premier 5.0軟件進行引物設計，所有序列引物由北京華大基因公司合成（表1）。PCR反應條件為95℃預變性5 min；95℃ 45 s，59℃ 45 s，64℃ 50 s，72℃ 45 s，共30個循環；72℃ 10 min終止反應。將PCR產物片段進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統拍照并采用Image J軟件進行灰度分析。

表1 IL-4、IL-5、IL-13及內參β-actin的PCR引物序列

1.2.5 血清CIC檢測 采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）進行測定，具體操作嚴格參照試劑盒說明書即可。1.2.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件對實驗數據進行分析，數據資料以（±s）表示，組間數據比較采用兩樣本均數t檢驗，以P＜0.05為比較差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光染色鏡檢結果

免疫熒光染色鏡檢結果顯示，正常組大鼠腎小球系膜區IgA、IgG、IgM及C3均呈陰性，模型組大鼠腎小球系膜區表現有明顯IgA沉積，熒光強度（++）-（+++），個別波及毛細血管壁并伴有IgG、IgM、C3沉積；低、中、高劑量組熒光強度較模型組依次減弱，其中高劑量組部分IgA熒光強度（±）-（-）。該結果提示造模成功，見圖1。

圖1 免疫熒光染色鏡檢結果

2.2 各組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的RT-PCR檢測結果

RT-PCR檢測結果表明，與正常組比較，模型組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的相對表達水平極顯著增高（P＜0.001），與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的相對表達水平均依次降低，各細胞因子指標組間兩兩比較均有統計學意義（P＜0.01），見圖2和圖3。

2.3 各組大鼠血清CIC檢測結果

CIC檢測結果顯示（表2），與正常組比較，模型組血清CIC濃度顯著升高（P＜0.01），低、中、高劑量組均高于正常組，但與正常組比較均無統計學意義（P＞0.05），與模型組比較均顯著更低（P＜0.05），并依次呈逐漸降低趨勢。

3 討論

IgAN及其所導致的慢性腎臟疾病及ESRD不僅對患者本身而言是一個非常嚴重的健康問題，而且其家庭也往往因此遭受沉重的經濟負擔，進一步提高IgAN臨床治療的有效性是腎病內科醫生所面臨的重大課題之一。當前西醫對IgAN尚缺乏特異性的治療方法，同時也沒有一個被普遍認可的治療指南，臨床主要采用轉換酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（ARB）等藥物給予支持治療，效果不理想則建議聯合應用激素治療。另有研究表明，激素聯合硫唑嘌呤治療IgAN不比激素單藥治療更有效反而增加藥物不良反應的發生［10］。隨著IgAN相關中醫理論研究的不斷深入，某些中醫藥已在IgAN的治療方面愈發表現出優勢，不僅能較好控制其近期臨床癥狀，而且能在很大程度上幫助患者激素減量并削弱西藥的毒副反應［11，12］。近期研究證實，白藜蘆醇在其他類型腎病的應用中已初具成效［13］。那么基于其抗炎作用是否對IgAN同樣具有臨床應用價值即是本研究重點關注的問題。

圖2 各組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的RT-PCR檢測結果

圖3 各組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13細胞因子的相對表達

IgAN的發病機制目前尚未完全探明，但考慮與免疫功能異常及遺傳等因素有關，其中前者占主要地位［14］。IgA等抗體是由經T細胞調節下活化的B細胞產生的。IL-4與IL-13是活化的Th2細胞所分泌的兩種非常重要的抗炎性細胞因子，它們對單核-巨噬細胞表面抗原的表達具調節作用，能對NO產生及抗體所介導的細胞毒性（ADCC）作用發揮抑制效應，同時還能下調諸如IL-1、TNF-A、IL-12等多種促炎細胞因子以及巨嗜細胞炎癥蛋白（MIP）、IL-8等趨化因子的合成水平，另外也能促進具抗炎作用的IL-ra與IL-1Ⅱ型受體的表達繼而間接抑制IL-1的生物學功能［15］?；趶姶蟮目寡滋匦裕琁L-4與IL-13均被認為對原發性腎小球疾病相關炎性反應具重要保護意義。IL-5則是由Th2細胞所分泌的另一種促炎性細胞因子，其在機體的炎性反應中發揮信息傳遞功能，并能促進B細胞分化及增殖［16］。故可間接增加IgA表達［17］。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的相對表達水平極顯著增高（P＜0.001），提示在IgAN病情進展過程中，可能基于機體免疫應答，不僅促炎性因子IL-5會有所增高，而且IL-4與IL-13抗炎性因子也同步增高。而與模型組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組大鼠腎組織IL-4、IL-5、IL-13的相對表達水平均依次降低，各細胞因子指標組間兩兩比較均有統計學意義（P＜0.01），則進一步提示在接受白藜蘆醇治療后，致炎細胞因子IL-5被下調，繼而將阻斷由致炎因子所致腎組織損害并減輕炎性反應，當炎性反應降低后作為抗炎因子的IL-4、IL- 13其表達水平也隨之降低。

CIC是抗原與抗體在循環中所結合形成的免疫復合物，腎臟是其發生沉積的敏感靶標。腎臟所接受的心輸出量為25%左右，抗原與抗體形成的復合物在流經腎臟時將導致腎小球內部呈高比例CIC狀態，繼而促使更大量的CIC可透過含大量帶負電荷成分（如硫酸類肝素與多糖蛋白等）的腎小球毛細血管壁，故導致帶正電荷的CIC易于在此發生沉積［18］。另外，CIC本身所具有的大分子量特征而不易被吞噬細胞吞噬也是其發生沉積的重要原因［19］。當CIC沉積于腎組織系膜區后，即可通過吸引或活化炎性細胞及腎小球固有細胞，繼而開始釋放多種炎性介質并引起細胞或組織損傷［20］。本次實驗顯示，與模型組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組CIC濃度均顯著更低（P＜0.05），這與IL-4、IL-13 mRNA表達情況一致。該結果也可以從另一角度做出推論：抗炎因子IL-4、IL-13的分泌增加可能正是因為IgA等免疫復合物沉積于系膜區，刺激局部產生炎癥反應，同時啟動了相應的抗炎機制所致。而白藜蘆醇則通過調節IL-4、IL-13的表達進而間接亦或直接影響Th1/Th2的平衡，減少活化Th2細胞，同時調節B細胞的增殖與活化減少抗體過度分泌，最終導致CIC形成量減少起到治療IgAN的效果。

表2 各組大鼠血清CIC檢測結果（n=10）

4 結論

白藜蘆醇可明顯下調IgA大鼠腎組織總促炎性因子IL-5的表達，炎性反應減弱后抗炎性因子IL-4與IL-13也隨之降低，同時白藜蘆醇也能顯著降低IgA大鼠血清CIC濃度，提示白藜蘆醇對IgAN不僅具積極免疫調節作用，而且也能較好阻遏其病機，可為IgAN患者的臨床治療提供新的思路。

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（責任編輯 馬鑫）

Effects of Resveratrol on Renal Tissue of TH2 Inflammatory Factors and CIC from Serum of Rats with IgA Nephropathy

ZHOU Min
（Jiangsu Food & Pharmaceutical Science College，Huai’an 223003）

This work aims to investigate the effects of resveratrol on renal tissues of IL-4，IL-5 and IL-13 TH2 inflammatory factors and circulating immunocomplex（CIC）from serum of rats with IgA nephropathy. Ten normal rats were used as the normal group，and the other 40 rats were treated with fetal bovine gamma globulin（BGG）for 9 weeks to become 4 groups of IgA nephropathy（IgAN）rats. Resveratrol was administered to them at the end of the 9th week. According to the different dose of the drug，they were defined as model group（no drug），low dose group（15 g crude drug/kg），middle dose group（30 g crude drug/kg），and high dose group（45 g crude drug/kg）. Then they were killed at the end of the 12th week，and the validity of the model was tested by immunofluorescence staining. The expression levels of IL-13，IL-5 and IL-4 renal tissues were detected by RT-PCR，and the CIC concentration of serum was measured by ELISA. Results showed that the experimental model was successful. In contrast to the normal group，the relative expression levels of IL-4，IL-5 and IL-13 in the model group were significantly higher（P ＜ 0.001）. Compared with the model group，the relative expression levels of IL-4，IL-5，and IL-13 in the low，middle and high dose groups decreased gradually，and the comparison of the cytokine indexes between every two groups had statistical significance（P ＜ 0.01）. Compared with the normal group，the CIC concentration from serum in the model group was significantly higher（P ＜ 0.01），and those in the low，medium and high dose groups were higher than the normal group，but there was no significant statistical significance when compared with the normal group（P ＞ 0.05）；moreover，they showed a gradually decreasing trend in comparison with the model group and they were significantly lower（P ＜ 0.05）. In summary，resveratrol significantly down-regulates the expressions of totalpro-inflammatory factor IL-5 in the renal tissues of IgA rats，and the anti-inflammatory factors IL-4 and IL-13 decrease their values after the inflammatory reaction decreased. Besides，resveratrol also significantly reduce the CIC concentration of serum in IgA rats.

resveratrol；IgA nephropathy；TH2 inflammatory factor；circulating immunocomplex

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1065

2016-11-26

周敏，女，碩士研究生，講師，研究方向：炎癥機制及藥物治療；E-mail：minzhou2016@163.com