用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法

趙紫霞徐桂彩，2李炯棠楊世勇

（1. 中國水產科學研究院 漁業生物技術北京市重點實驗室，北京 100141；2. 浙江海洋大學海洋科學與技術學院，舟山 316022；3. 四川農業大學動物科技學院，雅安 625014）

用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的生物傳感檢測方法

趙紫霞1徐桂彩1，2李炯棠1楊世勇3

（1. 中國水產科學研究院 漁業生物技術北京市重點實驗室，北京 100141；2. 浙江海洋大學海洋科學與技術學院，舟山 316022；3. 四川農業大學動物科技學院，雅安 625014）

旨在開發用于水產品物種鑒定的檢測方法，以鑒別虹鱒（Oncorhynchus mykiss）假冒大西洋鮭（Salmo salar）的現象。根據大西洋鮭和虹鱒基因組序列相似性比對結果，在核基因肌紅蛋白基因區設計了三對聚合酶鏈式反應擴增引物，分別為大西洋鮭特異性引物、虹鱒特異性引物和鮭鱒通用引物。在上游引物5'端標記生物素分子，使擴增產物被親和素修飾的電極表面捕獲錨定，在下游引物5'端標記二茂鐵分子，使擴增產物帶有電化學信號。基于以上方法構建了電化學生物傳感體系，通過循環伏安信號檢測特定擴增引物，從而能夠鑒別樣品是否來源于大西洋鮭或虹鱒。本研究構建的電化學生物傳感檢測方法具有準確、清潔的特點，能夠用于成魚、魚苗、魚卵、魚肉及其加工制品的物種鑒定，并能夠從混有其他物種DNA的樣品如魚泥中成功檢測魚肉DNA的物種來源。

大西洋鮭；虹鱒；物種鑒定；循環伏安；生物傳感

大西洋鮭（Salmo salar），屬于鮭科（salmonidae）、鮭屬（Salmo），20世紀60年代在挪威人工養殖成功，目前已經成為世界性的養殖魚類，主要以海水網箱的形式養殖生產商品魚［1］。國內大西洋鮭養殖產量較低，但以其為原料制作的三文魚刺身、煙熏三文魚及其它加工產品等很受消費者歡迎，在我國水產品市場上稱為“挪威三文魚”，銷售價格較高。

虹鱒（Oncorhynchus mykiss），屬于鮭科（Salmonidae）、大馬哈魚屬（Oncorhynchus），自19世紀起在美國開始淡水養殖，我國曾從朝鮮、美國、日本等國多次引種，目前在20多個省市區都有人工養殖，是國內養殖范圍較廣的冷水魚類［1］。目前市場上存在部分不法經營者使用虹鱒來冒充大西洋鮭［2，3］，向虹鱒飼料中添加色素，使原本為白色、青色的虹鱒肉呈現出類似大西洋鮭的橘紅色澤和紋理，偽稱進口的“挪威三文魚”高價銷售，嚴重侵害消費者權益。因此，迫切需要建立快速準確的檢測手段，用于大西洋鮭和虹鱒的物種鑒定。

隨著分子生物學技術的發展，以聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）為基礎的DNA分析成為目前物種鑒定方法的主流。例如，DNA條形碼技術［4-6］和熒光定量PCR［7-9］等。但DNA條形碼技術需要對PCR擴增產物進行測序，成本高且耗時較長；熒光定量PCR對設備和操作水平的要求較高。本研究致力于開發用于大西洋鮭和虹鱒物種鑒定的新型檢測方法，將PCR反應與電化學生物傳感檢測技術［10-12］結合起來，通過物種特異性DNA片段的擴增和產物循環伏安信號檢測，實現準確、靈敏、快捷、清潔無污染的水產品物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

大西洋鮭、虹鱒成魚：采自山東東方海洋科技股份有限公司、通威三文魚有限公司、北京臥佛山莊養殖有限公司；冰鮮三文魚刺身：購自北京岳各莊水產品市場；冷凍和加工三文魚產品：購自京東商城；海洋動物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP：美國Thermo Fisher 公司；RNA酶A、Al2O3、納米金（粒徑30 nm，檸檬酸鈉還原氯金酸法制備）溶液、殖-硫辛酸、EDC/NHS羧基活化液、親和素：美國Sigma-Aldrich公司；所有引物均由上海生工公司合成；實驗使用去離子水；化學試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 大西洋鮭和虹鱒基因組數據檢索在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）的基因和核酸數據庫中進行，序列相似性比對使用NCBI在線BLAST工具和CLC Genomics Workbench軟件完成，引物設計使用Primer 3軟件完成。

1.2.2 電極表面修飾 使用Al2O3粉末拋光金圓盤電極（直徑3 mm），分別用乙醇和去離子水在超聲條件下清洗電極表面各10 min，在0.5 mol/L硫酸中進行循環伏安掃描，初始電位-200 mV，折回電位+1 500 mV，掃描速率100 mV/s，至循環伏安圖不再變化為止。浸入納米金溶液，+1.55 V電位下沉積15 min，靜置5 min，去離子水清洗。

電極表面浸入含10 mmol/L α-硫辛酸的乙醇溶液活化20 min，移入濃度為100 g/L 的EDC/NHS混合液活化羧基，向電極表面滴加0.2 g/L的親和素50 μL，偶聯30 min，去離子水洗脫未結合親和素。保存于4℃，pH 7.0 磷酸緩沖液中。

1.2.3 基因組DNA提取與擴增 取成魚鰭條，或加工水產品待測樣品約100 mg，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取基因組DNA，溶于滅菌去離子水，RNA酶A處理去除RNA污染。使用NanoVue plus紫外分光光度計（美國GE）測定濃度，并調整DNA濃度在100 ng/μL左右。

定制合成引物序列如表1所示。以2.0 μL基因組DNA為模板，使用Applied Biosystems Veriti 96孔PCR儀（美國Thermo Fisher）分別擴增大西洋鮭特異性引物、虹鱒特異性引物和鮭鱒通用引物，PCR反應程序為：（1）94℃，1 min；（2）94℃，30 s；（3）60℃，30 s；（4）72℃，90 s，返回步驟（2），25個循環；（5）72℃，10 min；（6）4℃ 至反應終止。

1.2.4 電化學檢測 取20 μL PCR擴增產物，無需純化，分別滴加在修飾有生物素的金電極表面，37℃溫育30 min。將DNA修飾電極浸入pH 7.0 Tris-EDTA緩沖液，洗脫5 min，換新的緩沖液重復洗脫2次。

采用三電極測試系統，以DNA修飾電極為工作電極，鉑絲（直徑1 mm）為對電極，Ag/AgCl 為參比電極，20 mL pH 7.0 磷酸緩沖溶液為支持電解質，使用283A電化學工作站（美國EG&G）測定循環伏安曲線，初始電位設為0 mV，折回電位設為+ 600 mV，掃描速度設為50 mV/s，記錄3個循環中的第3個。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳對照 基因組DNA提取與擴增步驟與1.4相同，PCR反應程序中步驟（4）改為35個循環。使用含0.5 μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠，在PowerPac電泳儀（美國BIO-RAD）上電泳檢測PCR擴增產物，90 V，30 min。

2 結果

2.1 物種特異性序列的篩查和引物設計

在NCBI基因數據庫中檢索獲得大西洋鮭（Gene ID：100195613） 和 虹 鱒（Gene ID：100329203）肌紅蛋白（Myoglobin，mb）基因信息，將其與全基因組測序數據比對獲得相應基因組序列，其中大西洋鮭mb基因位于序列Accession NO：AGKD04001111.1的46 021-54 000堿基（base pair，bp）位置，共計7 980 bp，虹鱒mb基因位于序列Accession NO：FR908943.1的1-8 040堿基位置，共計8 040 bp。

序列相似性比對結果顯示，兩條序列中長度為9 736 bp的區域為同源性序列，同源區序列一致性（identity）為82.9%，缺失（Gap）比例為10.0%，其中存在3個序列差異較大的區域：在虹鱒2 134-2 286 bp區間，兩個物種序列長度相似，但序列一致性僅為37.1%；在虹鱒3 832-3 807 bp區間，大西洋鮭存在72 bp缺失；在虹鱒5 536-5 537 bp區間，大西洋鮭存在108 bp插入。因此，物種特異性引物主要在這3段差異序列區設計，大西洋鮭和虹鱒通用引物則在序列保守區設計，引物序列和修飾信息見表1，引物的位置和序列保守性見圖1-圖3。

表1 引物序列和修飾信息表

圖1 大西洋鮭特異性引物的基因組位置比對圖

圖2 虹鱒特異性引物的基因組位置比對圖

圖3 鮭鱒通用引物的基因組位置比對圖

2.2 物種鑒別檢測流程設計

本研究設計的用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的電化學生物傳感檢測流程如圖4所示：（1）首先對待測樣品進行DNA提取，后續PCR反應對模板DNA質量要求不高，因而使用各種常規DNA提取方法如酚-氯仿抽提法、鹽析法及各種市售試劑盒均可；（2）接下來分別使用3對引物對樣品DNA進行PCR擴增，上游引物帶有錨定分子生物素標記，下游引物帶有電化學指示劑二茂鐵標記，若樣品中包含目標基因組序列，即可擴增得到雙端帶有標記的DNA片段，大西洋鮭特異性引物的擴增長度為1 726 bp，虹鱒為1 627 bp，鮭鱒通用引物的擴增長度為428 bp；（3）然后將各組PCR擴增產物分別加至修飾有親和素的金電極表面，由親和素充當錨定受體，將帶有生物素標記的DNA分子穩固結合在電極表面，而未結合的引物、模板等通過洗脫反應移除；（4）最后，通過檢測DNA擴增片段另一端標記的二茂鐵分子的電化學信號，判斷特定PCR擴增產物是否存在，鑒別待測樣品的所屬物種。

2.3 PCR擴增產物的循環伏安測試

大西洋鮭樣品檢測結果如圖5所示。曲線（1）和（3）均呈現明顯的氧化還原峰，表明大西洋鮭特異性引物和鮭鱒通用引物成功擴增，樣本中含有大西洋鮭基因組DNA；而曲線（3）無氧化還原峰，顯示虹鱒特異性引物未能擴增，樣本中不含虹鱒基因組DNA。

虹鱒樣品檢測結果如圖6所示，曲線（2）和（3）出現氧化還原峰，而曲線（1）維持未反應的平滑狀態，結果符合預期，樣本中含有虹鱒基因組DNA，未檢出大西洋鮭基因組DNA。

圖4 用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的電化學生物傳感檢測流程示意圖

圖5 大西洋鮭樣品檢測的循環伏安信號

2.4 實際樣品檢測

應用本研究開發的電化學生物傳感方法，對32個實際樣品進行電化學檢測，并使用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行對照檢測，結果見表2。所有樣品的電化學檢測結果與電泳檢測結果均一致。在15例采自不同養殖種群、不同品種的成魚樣品中，檢測結果與形態學判定結果均一致。

圖6 虹鱒樣品檢測的循環伏安信號

表2 電化學生物傳感方法檢測大西洋鮭和虹鱒樣品結果

3 討論

目前的物種DNA鑒定技術，擴增對象以線粒體DNA為主［4-9］，如細胞色素C 氧化酶I（Cytochrome oxidase subunit I，COI）、細胞色素B（Cytochrome b，Cyt b）、D-loop控制區等。線粒體DNA具有母系遺傳特征，無法反映父母雙親的遺傳背景，在用于人工育成品種的遺傳分析時往往導致混亂。而在水產養殖業中，雜交育種是使用較為廣泛的育種技術，鮭鱒雜交研究由來已久［13，14］，且有部分品種已推廣養殖，如斑點鱒鮭［15］等。為避免鑒定線粒體基因對雜交品種的誤判，本研究選擇核基因mb作為物種鑒定的靶序列，PCR擴增結果同時包含待測樣本父母本的基因信息。

mb基因編碼產物是生物體內的氧貯存和轉運蛋白［16，17］。作為具有重要生理功能且在基因組內僅有唯一拷貝的基因，在物種內，mb基因結構和序列都具有較高的保守性［18，19］，在該基因區設計引物，可使物種內變異導致的PCR擴增假陰性概率顯著降低。在兩物種基因序列的高度差異區設計鑒別引物，則大大提高了引物的特異性，避免引物區僅有少量堿基差異，在擴增中發生堿基錯配而導致假陽性擴增。

除兩對物種特異性引物外，本研究還設計了一對鮭鱒通用引物，在大西洋鮭和虹鱒基因組中都能有效擴增，用作實際樣本檢測中的對照，指示所有實驗流程正常。若通用引物檢測無信號，提示應排查試劑和實驗操作問題。

本研究設計使用電化學檢測方法檢測PCR擴增產物。與常規的DNA檢測手段相比，電化學檢測不像聚丙烯酰胺凝膠法、瓊脂糖凝膠法等電泳方法涉及有毒有害試劑操作，既保護了檢測人員的健康，也避免了潛在的環境污染風險；又不像熒光標記檢測需要避光，降低了檢測操作的繁瑣性，因而在DNA分析中呈現出廣泛的應用前景，如第三代測序Oxford Nanopore即采取納米孔電信號檢測取代熒光檢測來實現單分子測序［20］。此外，電化學檢測裝置成本較低，易于小型化、微陣列化，在實時、現場檢測中，電化學檢測更具有明顯的優勢［10-12，21］。

通過在上下游引物5'端分別標記生物素和二茂鐵，使擴增成功的PCR產物同時帶有兩種標記分子，生物素標記使PCR產物被修飾有親和素的電極表面所捕獲，二茂鐵標記則在電極表面產生可檢測的電化學信號。二茂鐵的電化學信號檢測［21-23］使用循環伏安法、差分脈沖伏安法、交流阻抗法等均可實現，本研究使用循環伏安法。

比較圖5和圖6中的各條循環伏安曲線，發現相同鮭鱒通用引物在大西洋鮭和虹鱒中各自擴增的產物對應曲線形狀基本相同，即圖5和圖6中的曲線（3），而不同引物擴增產物對應的循環伏安曲線形狀存在一定差異。鮭鱒通用引物擴增序列在大西洋鮭和虹鱒參考基因組中僅存在24個堿基差異，產物的長度和堿基組成都高度相似，它們的循環伏安曲線基本重疊，表明在測試體系中，二茂鐵標記產物的電化學行為穩定，檢測結果重復性較高。而兩種物種特異性引物擴增產物的循環伏安曲線與前述曲線相比，氧化峰和還原峰的位置均出現了一定程度的偏移，氧化還原峰電位差明顯增大，可能是因為，較長的DNA片段阻礙了遠端標記的二茂鐵分子到電極表面之間的電子轉移；氧化還原峰電流值也有所增大，可能是因為PCR反應擴增效率不同所導致的。以上發現提示我們，在今后的傳感器設計中，可以通過不同長度和堿基組成的PCR擴增產物設計，實現不同產物的電化學信號區分，從而合并反應體系，在同一管內進行多重PCR反應，使用同一支電極對多重PCR產物進行檢測，進一步簡化檢測流程，降低檢測成本。

使用本研究開發的電化學生物傳感檢測方法，對32個實際樣品進行了物種鑒別。在15例采自不同養殖種群、不同品種的成魚樣品中，檢測結果與形態學判定結果均一致，表明本方法用于物種鑒別的準確率較高。

在17例市售魚類加工制品檢測中，有3例樣品檢測結果與標稱不一致，包括產地未知的冰鮮三文魚刺身2例，標稱產地為挪威的煙熏三文魚1例，可能為虹鱒冒充大西洋鮭。另有標稱產地為美國的三文魚泥1例，大西洋鮭和虹鱒特異性引物檢測均顯示陰性，而鮭鱒通用引物檢測呈陽性，提示含有其它鮭鱒魚類成分，考慮到市場上“三文魚”名稱使用較為混亂，銀鮭（Oncorhynchus kisutch）、紅鮭（Oncorhynchus nerka）、大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）等原產于太平洋的鮭科物種經常被稱為“太平洋三文魚”，推測該產品中的三文魚成分可能屬于此類。以上結果提示，市售大西洋鮭產品確實存在少量冒充或誤標物種來源的問題，為保障消費者權益，在水產品質量安全監管中有必要開展物種鑒定檢測。

4 結論

本研究利用大西洋鮭和虹鱒mb基因的基因組序列相似性比對結果，設計了物種特異性引物，建立了基于PCR擴增反應的電化學生物傳感體系，通過在上下游引物5'端分別標記生物素和二茂鐵分子，實現擴增產物在電極表面的錨定和循環伏安信號檢測，成功構建了用于鑒別大西洋鮭和虹鱒的電化學生物傳感檢測方法。本方法能夠用于成魚、苗種、魚卵、魚肉及其加工制品的物種鑒定，并能夠從混有其他物種DNA的樣品如魚泥中成功檢測魚肉DNA的物種來源，在水產品質量檢測中具有良好的應用前景。

［1］孫大江, 王炳謙. 鮭科魚類及其養殖狀況［J］. 水產學雜志, 2010, 23（2）：56-63.

［2］劉樂平. 如何放心享用三文魚 杭州三文魚消售狀況調查側記［N］. 中國漁業報, 2011-2-28（008）.

［3］區君君. 生食三文魚先學辨真假 虹鱒魚可冒充三文魚賣［N］.新快報, 2012-10-12（F05）.

［4］Rasmussen RS, Morrissey MT, Hebert PD. DNA barcoding of commercially important salmon and trout species（Oncorhynchus and Salmo）from North America［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57（18）：8379-8385.

［5］Bhattacharya M, Sharma AR, Patra BC, et al. DNA barcoding to fishes：current status and future directions［J］. Mitochondrial DNA A DNA Mapp Seq Anal, 2016, 27（4）：2744-2752.

［6］王爽, 李永波, 馬超峰, 等. DNA 條形碼COI 序列在常見肉類鑒別中的應用研究［J］. 現代食品科技, 2016, 32（1）：188-193.

［7］Herrero B, Vieites JM, Montserrat E. Authentication of Atlantic salmon（Salmo salar）using real time PCR［J］. Food Chemistry, 2011, 127（3）：1268-1272.

［8］郭云霞, 張舒亞, 諶鴻超, 等. SYBR Green 實時熒光PCR 檢測食品中鯊魚源性成分真實性方法的建立［J］. 食品與生物技術學報, 2012, 31（12）：1300-1306.

［9］李新光, 趙峰, 馬麗萍, 等. 基于SYBR-Green 熔解曲線快速鑒別挪威三文魚及其制品的方法［J］. 中國食品學報, 2014, 14（3）：170-176.

［10］Emil P, Martin B. Electrochemistry of nucleic acids［J］. Chemistry Review, 2012, 112（6）：3427-3481.

［11］Kimmel DW, LeBlanc G, Meschievitz ME, et al. Electrochemical sensors and biosensors［J］. Anal Chemi, 2012, 84（2）：685-707.

［12］劉剛, 萬瑩, 鄒子英, 等. 脫氧核糖核酸分子設計在電化學生物傳感器中的應用［J］. 分析化學, 2011, 39（7）：953-962.

［13］ Chevassus B. Hybridization in salmonids：Results and perspectives［J］. Aquaculture, 1979, 17（2）：113-128.

［14］徐紹剛, 楊曉飛, 田照輝, 等. 硬頭鱒與溪紅點鮭雜交三倍體育種技術的初步研究［J］. 動物學雜志, 2016, 51（5）：887-894.

［15］申照亮. 山東推廣斑點鱒鮭引種與養殖產業開發［N］. 中國高新技術產業導報, 2011-5-30（B08）.

［16］Vinogradov SN, Moens L. Diversity of globin function：enzymatic, transport, storage, and sensing［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283（14）：2773-2777.

［17］ Rezende EL. Better oxygen delivery［J］. Science, 2013, 340（6138）：1293-1294.

［18］Hoffmann FG, Opazo JC, Storz JF. Whole-genome duplications spurred the functional diversification of the globin gene superfamily in vertebrates［J］. Mol Biol Evol, 2012, 29（1）：303-312.

［19］Zhao Z, Xu P, Cao D, et al. Duplication and differentiation of common carp（Cyprinus carpio）myoglobin genes revealed by BAC analysis［J］. Gene, 2014, 548（2）, 210-216.

［20］Brown CG, Clarke J. Nanopore development at Oxford Nanopore［J］. Nature Biotechnology, 2016, 34（8）：810-811.

［21］Sassolas A, Leca-Bouvier BD, Blum LJ. DNA biosensors and microarrays［J］. Chemistry Review, 2008, 108（1）：109-139.

［22］Fan C, Plaxco KW, Heeger AJ. Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequencespecific detection of DNA［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100（16）：9134-9137.

［23］Saleem M, Yu H, Wang L, et al. Review on synthesis of ferrocenebased redox polymers and derivatives and their application in glucose sensing［J］. Analytica Chimica Acta, 2015, 876（23）：9-25.

（責任編輯 狄艷紅）

Electrochemical Bio-sensing Method for Identification of Atlantic Salmon and Rainbow Trout

ZHAO Zi-xia1XU Gui-cai1，2LI Jiong-tang1YANG Shi-yong3
Beijing Key Laboratory of Fishery Biotechnology，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；2. Marine Science and Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316022；3. College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014）

This study aims to develop new method for species identification of aquatic products，in order to distinguish Atlantic salmon（Salmo salar）adulterated by rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）. Based on genomic sequence alignment of Atlantic salmon and rainbow trout，three pairs of polymerase chain reaction（PCR）primers in the genomic region of a nuclear gene myoglobin were designed，which were Atlantic salmon-specific primers，rainbow trout-specific primers，and universal primers for both salmon and trout，respectively. The 5’ ends of forward primers were labeled with biotin，thus the amplification products were able to be captured and anchored on the avidin-modified electrode surfaces. And the 5’ ends of reverse primers were labeled with ferrocene，which made the amplification products electrochemically active and capable to be detected by cyclic voltammetry. The constructed electrochemical bio-sensing system accurately and safely identified whether the samples were from Atlantic salmon or rainbow trout. Moreover，varied samples were applicable，including adult fish，fry，eggs，as well as processed fish products，such as fish paste containing multiple DNA sources. Therefore，the electrochemical bio-sensing detection method established in this study has promising prospects in quality inspection system for aquatic products.

Atlantic salmon；rainbow trout；species identification；cyclic voltammetry；bio-sensing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1067

2016-11-22

國家科技支撐計劃項目（2015BAD25B01）

趙紫霞，女，博士，副研究員，研究方向：水產生物技術；E-mail：zhaozx@cafs.ac.cn