QuEChERS—超高效液相色譜—串聯質譜法測定食用菌中7種熒光增白劑

張憲臣+李蓉+周艷萍+薄艷娜+王京力+胡儀光

摘 要 建立了QuEChERS超高效液相色譜串聯質譜法（UPLCMS/MS）測定食用菌中7種熒光增白劑殘留量的檢測方法。樣品前處理采用QuEChERS方法， 食用菌樣品用水浸潤后， 以甲酸和乙腈提取目標物， C18填料、正丙基乙二胺（PSA）和MgSO4凈化， C18色譜柱分離， 乙腈和0.1%甲酸梯度洗脫， 多反應監測（MRM）正離子模式掃描。在優化條件下， 7種熒光增白劑在一定質量濃度范圍內線性關系良好， 相關系數均大于0.991， 方法檢出限（S/N=3）在0.05～0.40 μg/kg之間， 定量低限（S/N≥10）在0.2～1.3 μg/kg之間， 方法的平均回收率在70.1%～109.2%之間。本方法具有操作簡單快捷、靈敏度高等優點。

關鍵詞 超高效液相色譜串聯質譜法； 熒光增白劑； 食用菌

1 引 言

熒光增白劑（Fluorescent whitening agents， FWAs）是一種熒光染料， 又稱為白色染料， 是一種能吸收不可見的紫外光（波長300～400 nm）， 再激發出可見的藍色或藍紫色熒光（波長420～480 nm）的復雜有機化合物[1]。食用菌中熒光增白劑的來源主要有兩方面： 人為添加和包裝材料污染。食用菌中常檢測到的熒光增白劑包括化學結構屬香豆素類型熒光增白劑（如C.I. 140）、化學結構屬吡唑啉類型熒光增白劑（如C.I. 135、C.I. 185、 C.I. 367、C.I. 393、 C.I. 184）和化學結構屬三嗪氨基二苯乙烯型熒光增白劑（如C.I. 353）， 這些熒光增白劑在人體內不易被分解， 其毒性累積在肝臟或其它重要器官， 成為潛在的致癌因素[2]。國家衛生標準GB/T 307982014食品用洗滌劑試驗方法——熒光增白劑的測定中明確規定： 食品包裝用原紙、餐具洗滌劑、食品工具設備用洗滌劑與洗滌消毒劑中均不得檢出熒光性物質， 但至今未見關于食用菌中熒光增白劑的測定的國家和行業標準， 僅有2009年四川省地方標準DB 51/T9072009食用菌中熒光增白劑檢驗規程的相關報道， 但是該標準采用紫外分光光度法進行檢測， 僅能對食用菌中熒光增白劑進行定性分析， 無法對熒光增白劑的種類和含量進行測定， 且人為誤差大。

目前， 熒光增白劑的檢測方法主要有光譜法和色譜法。 光譜法包括白度法、熒光分光光度法和紫外分光光度法； 色譜法則包括高效液相色譜法（HPLC）[3]和高效液相色譜法質譜聯用法（HPLCMS/MS）[4～9]等。光譜法只能對熒光增白劑進行半定量檢測， 且受人為因素和設備的影響較大； 對于組成復雜的樣品， 測定結果的準確性難以保證， 不適用于監督執法部門的相關執法檢測。液相色譜法只能依靠化合物的保留時間定性， 易受雜質干擾。液相色譜質譜聯用法采用保留時間與特征離子對比例對已知目標物進行定性和定量分析， 準確性和靈敏度優勢明顯。目前， 對食品接觸材料中的熒光增白劑研究較多[10]， 尚未見關于食用菌中熒光增白劑檢測的報道。黃薇等[11]采用高效液相色譜法測定食用菌中10種熒光增白劑， 張建瑩等[12]采用超高效液相色譜法質譜聯用法（UPLCMS/MS）測定食用菌中3種熒光增白劑， 這些研究均采用固相萃取對樣品進行前處理。QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）是基于分散固相萃取發展起來的一種集萃取和凈化為一體的新型前處理方法， 能夠有效縮短前處理時間， 提高檢測效率， 已在農藥殘留檢測、臨床醫學、獸藥及醫藥殘留等領域中廣泛應用[4～12] 。本研究利用QuEChERS前處理方法對食用菌中熒光增白劑進行凈化處理， 平行定量濃縮儀濃縮提取液， 采用UPLCMS/MS進行測定， 建立食用菌中7種常用的熒光增白劑的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Ekspert Ultra LC100超高效液相色譜系統、AB5500三重四極桿質譜儀（美國AB公司）； BECHMAN Coulter Avanti J26XP超高速冷凍離心機； 平行定量濃縮儀、再循環冷卻系統B740、真空泵V700/701（瑞士BUCHI公司）； 渦旋振蕩器（德國IKA公司）； DTYB1200（電子天平， 福州華志科學儀器有限公司）。

標準品： C.I. 162（純度≥94.0%）、C.I. 140（純度≥94.0%）、C.I. 135（純度≥95.0%）、C.I. 185（純度≥98.0%）、C.I. 367（純度≥98.0%）、C.I. 393（純度≥98.0%）和C.I. 184（純度≥98.0%）， 均購自美國International Laboratory 公司； 甲醇、乙腈 、無水MgSO4（色譜純， 美國Fisher公司）； 丙基乙二胺（Primary secondary amine， PSA）、C18（分析純， 粒徑40～63 μm上海安譜公司）。實驗用MilliQ超純水（美國Millipore公司）。鮮香菇、鮮平菇、鮮金針菇和干香菇由中山檢驗檢疫局食品監管科提供， 凍干松茸由中山援藏工作組提供。

2.2 標準溶液配制

準確稱取熒光增白劑標準品50.0 mg， 用三氯甲烷溶解并定容至50 mL， 制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液， 置于4℃保存。

準確吸取適量的C.I. 162， C.I. 140， C.I. 135， C.I. 185， C.I. 367， C.I.393和C.I. 184儲備液于100 mL容量瓶中， 用乙腈定容至， 配成各熒光增白劑相應濃度為320 μg/mL混合標準工作液。

2.3 液相色譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱： Phenomenex Kinetex （100 mm×2.1 mm， 2.6 μm）； 柱溫： 40℃； 進樣量： 10 μL； 流動相： A為乙腈， B為0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序： 0～1.0 min， 10% A； 1.0～8.0 min， 10%～90% A； 8.0～15.5 min， 90% A； 15.5～16.0 min， 90%～10% A； 16.0～20.0 min， 10% A。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子（ESI）源； 離子源溫度： 550℃； 正離子掃描； 多反應監測（MRM）模式檢測； 霧化氣（Gas1）流量：55.0 L/h； 加熱輔助氣（Gas2）流量： 55.0 L/h； 氣簾氣（Curtain gas）流量： 30.0 L/h； 噴霧電壓（IS）： 5500 V； 其余質譜參數見表 1。

2.4 樣品預處理

稱取粉碎均勻試樣2.0 g（干制食用菌樣品稱樣量為1.0 g）， 加入10 mL水， 然后加入10 mL 2%甲酸乙腈溶液（2∶98， V/V）和2.0 g NaCl， 渦旋振蕩5 min， 在4℃ 15000 r/min離心10 min， 上層液轉移至已提前放入 50 mg C18、120 mg PSA、500 mg MgSO4的15 mL離心管中， 渦旋振蕩5 min， 在5℃以15000 r/min離心10 min， 上清液移至15 mL離心管中， 于50℃平衡定量濃縮儀中濃縮至干。 殘留物加1.0 mL乙腈渦旋溶解， 過0.2 μm濾膜， 超高效液相色譜串聯質譜測定。

3 結果與分析

3.1 色譜條件優化

選擇對弱極性較強化合物分離較好的3種色譜柱Phenomenex Kinetex C18（100 mm × 2.1 mm， 2.6 μm）、 RESTEK ultra AQ C18 （100 mm×2.1 mm， 3.0 μm）和Thermo Hypersil GOLD C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.0 μm）對7種熒光增白劑進行分離， 結果表明， ESTEK ultra AQ C18和Thermo Hypersil GOLD C18這兩款色譜柱無法保留C.I. 162， 且其它6種熒光增白劑保留時間不穩定； Phenomenex Kinetex C18色譜柱對7種熒光增白劑有較好的保留， 穩定性好， 因此選擇Phenomenex Kinetex C18進行分析。 通過對3種色譜柱的比較， 發現色譜柱的粒徑對7種熒光增白劑的分離有較大影響， 粒徑越小， 分離效果越好。

在不同流動相色譜條件下3種色譜柱均難以基線分離C.I. 367和C.I. 393， 只能進行質譜分離。

比較了乙酸銨溶液和甲酸溶液緩沖溶液對7種熒光增白劑的質譜響應和色譜分離的影響， 結果表明， 使用乙腈0.1%甲酸溶液為流動相， 7種目標化合物的質譜響應顯著增加， 色譜峰峰形尖銳， 對稱性好， 所以本研究選擇乙腈0.1%甲酸溶液為流動相（圖1）。

3.2 質譜條件優化

質譜條件的優化通過在流動注射模式下對1.0 μg/mL的7種熒光增白劑單獨進樣完成。在正離子模式下， ESI中7種熒光增白劑的靈敏度明顯高于APCI。采用一級質譜對目標化合物進行母離子全掃描， 分析得到[M+H]+分子離子峰； 再采用二級質譜， 以分子離子為母離子， 優化CE、DP、EP、CXP等參數， 對目標化合物的子離子進行全掃描， 選擇信噪比比較高的兩個子離子， 與分子離子組成定性和定量離子對。由于C.I.367和C.I.393結構相似， 色譜條件難以分離， 通過優化質譜條件， C.I.367的母離子為m/z 363、定量離子為m/z 270； C.I.393的母離子為m/z 415、定量離子為m/z 321， 兩種熒光增白劑通過質譜可以很好地進行定性與定量分析。7種熒光增白劑分子結構中都含有苯基集團， 分子結構比較穩定， 因此， 優化過程中所需的碰撞能量較大。

3.3 QuEChERS處理條件優化

3.3.1 萃取溶劑的優化 選擇陰性鮮香菇為實驗材料， 添加3.0 μg/kg 混合標準品溶液， 每個樣品平行測定3次，采用外標法對萃取溶劑進行優化。萃取溶劑選取了QuEChERS方法中常用的5種試劑： 乙腈、2%甲酸乙腈溶液（2∶98， V/V）、0.5%氨水乙腈溶液（0.5∶99.5， V/V）、乙酸乙酯、丙酮。

結果（見圖2）表明， 用乙酸乙酯和丙酮提取時， 7種熒光增白劑的回收率低于50%， 達不到檢測要求； 用0.5%氨水乙腈溶液提取時， C.I. 393和C.I. 184的回收率達不到檢測要求； 用乙腈、酸化乙腈提取時， 回收率均可滿足檢測方法的要求， 但是乙腈提取時C.I.184峰形較差， 基質影響大； 加入2%甲酸后， 減少了基質對各種熒光增白劑組分干擾。因此， 本研究選擇2%甲酸乙腈溶液作為提取劑。

3.3.2 吸附條件的優化 目前常用的吸附劑主要有 C18、PSA 和 GCB（石墨化炭黑）。本研究選擇陰性鮮香菇為實驗材料， 添加3.0 μg/kg混合標準品溶液， 每個樣品平行測定3次， 采用外標法對吸附劑進行優化（圖3）。結果表明， C18用量在20～90 mg范圍內， 7種熒光增白劑的回收率在35%～104%之間， C18用量為50 mg時7種熒光增白劑回收率達到最高（95%～104%）； PSA用量在40～200 mg范圍內， 7種熒光增白劑的回收率為25%～102%， 用量為120 mg時7種熒光增白劑回收率達到最高（94%～102%）； MgSO4用量在200～900 mg范圍內， 7種熒光增白劑的回收率在36%～106%之間， 在500 mg時， 7種熒光增白劑回收率達到最高（94%～106%）。 本研究最終選擇50 mg C18， 120 mg PSA和500 mg MgSO4為最佳吸附條件。

3.3.3 離心條件和濃縮條件的優化 QuEChERS前處理方法中多采用無水MgSO4替代無水Na2SO4作為脫水劑， 因為無水MgSO4具有更強的脫水效果、更細的顆粒， 但其在吸水過程中放熱劇烈， 在渦旋過程中產生的熱氣會將離心管的蓋沖開， 影響7種熒光增白劑的回收率。 本實驗采用低溫高速離心分離提取液， 再加入無水MgSO4等， 此時放熱比較溫和， 不會出現很多的熱氣， 而放出的熱量剛好將提取液的溫度提高到37℃左右， 這個溫度既不會導致7種熒光增白劑分解， 還可以減少食用菌基質干擾， 提高提取效率。為了提高7種熒光增白劑的檢出限量， 本研究選擇平行樣品定量濃縮儀減壓濃縮樣品提取液， 并對濃縮的條件進行優化， 確定濃縮溫度為40℃； 冷凝溫度為

2℃； 真空度采用梯度下降的方式（30.0 kPa 6 min， 10.0 kPa 6 min， 4.0 kPa濃縮至干）。本方法可以同時濃縮處理24份樣品提取液， 完全濃縮至干僅需0.5 h， 有效降低了檢測成本， 提高了檢測質量和效率。

3.3.4 鹽濃度的影響 在提取過程中， 向樣品溶液中加入無機鹽， 既可以改變待測組分的提取效率， 又可以使兩相間的分層更加明顯[4]。在其它實驗條件不變的情況下， 選擇陰性鮮香菇為實驗材料， 添加3.0 μg/kg混合標準品溶液， 每個樣品平行測定3次， 采用外標法對NaCl的添加量（0.0～4.0 g）進行優化（圖3）。結果表明， 加入2.0 g NaCl時， 7種熒光增白劑的回收率最高， 增加NaCl的添加量， 回收率反而下降， 這是因為適量的NaCl能增加溶液的離子強度， 加大目標物從水相到萃取劑的傳質效率， 但NaCl濃度過大會導致萃取效率降低。因此， 本實驗選擇在樣品中加入2.0 g NaCl。

3.4 方法學驗證

3.4.1 標準曲線、檢出限和定量限 準確量取適量混合標準儲備工作液， 用乙腈溶液稀， 配制混合標準品工作液。結果表明， 各種化合物在質量濃度范圍內線性良好， 相關系數（r）均大于0.9900， 以3倍和10倍信噪比分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）（以鮮食用菌計）， 結果見表2。

3.4.2 方法準確度和精密度 在陰性食用菌樣品（包括鮮平菇、干香菇和凍干松茸）中進行加標回收實驗， 并進行精密度驗證。 在鮮平菇樣品中添加1.5、 3.0和15 μg/kg濃度水平標準品，進行6次平行加標實驗， 平均回收率在70.1%～109.2%之間， 相對標準偏差（RSD）在1.2%～7.0%之間（見表3）； 在干香菇樣品中添加3.0、 6.0和30 μg/kg標準品，進行濃度水平6次平行加標實驗， 平均回收率在74.2%～107.5%之間， RSD在3.2%～7.2%之間（表4）； 在凍干松茸樣品中添加3.0、 6.0和30 μg/kg濃度水平標準品，進行6次平行加標實驗， 平均回收率在76.4%～108.5%之間， RSD在2.5%～6.5%之間（見表5）。

3.5 實際樣品分析

利用本方法檢測14批實際樣品（包括3批鮮香菇樣品、5批鮮平菇樣品、4批干香菇樣品和2批凍干松茸樣品）， 在1批鮮香菇樣品中檢出熒光增白劑C.I. 393， 檢出量為16.7 μg/kg。

本研究結果表明， 建立的食用菌中7種熒光增白劑的 UPLCMS/MS的檢測方法靈敏、快速、簡單、準確、省時、穩定， 實用性強， 方法學結果滿足GB/T 274042008《實驗室質量控制規范》的技術要求， 適用于食品實驗室大批量檢測食用菌樣品。

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