大豆苷元與氨基修飾β—環糊精包合物的制備、表征及水溶性

鄧穎慧+蘇麗娜+龐艷華+郭亞飛+王芬+廖霞俐+楊波

摘 要 采用飽和水溶液法制備了大豆苷元分別與兩種氨基修飾β環糊精（ACD） 即單6氨基β環糊精（NCD） 和單6乙二胺基β環糊精（ENCD） 的固體包合物，并獲得最佳包合條件：大豆苷元與環糊精投料比為3∶1（n/n） ，攪拌時間為72 h，分別獲得83%和67%的產率。利用X射線粉末衍射和熱重分析對其進行了表征，證實了兩種包合物的形成。利用Job′s曲線法確定了主客體的包合比為1∶1，并利用熒光光譜滴定分析測得其包合穩定常數KS分別為899.2和203.8 L/mol。水溶性實驗表明，通過與NCD和ENCD形成包合物，25℃下大豆苷元在水中的溶解度由原來的8.31 μg/mL增至15.2和13.2 mg/mL，分別提高了約1800和1500倍。

關鍵詞 大豆苷元；氨基修飾β環糊精；固體包合物；包合行為；水溶性

1 引 言

大豆苷元，即7，4′二羥基異黃酮（Daidzein，圖1） ，又名黃豆苷元、大豆黃酮、大豆素等，是一種重要的異黃酮類化合物，主要存在于豆科類植物如大豆和葛根中。研究表明，大豆苷元具有多種重要的藥理作用，主要包括抗血栓和動脈粥樣硬化的形成[1]、抗糖尿病[2，3]、抗氧化[4，5]、骨骼保護[6，7]及抗腫瘤等作用[8，9]，同時，大豆苷元還通過在腸道中代謝為Sequol而具有雌激素樣的作用[10，11]。但是，大豆苷元溶解性差，穩定性低，口服吸收差，致使其生物利用度低，體內吸收量少，大大阻礙了其藥理作用的有效發揮[12，13]。化學修飾手段，如成酸[14，15]、成鹽[16，17]和糖苷化[18，19]等，是近年來報道的提高大豆苷元的水溶性最為常見的途徑。但是，這些方法常存在制備困難、水溶性提高程度有限及大豆苷元活性受到影響等不利因素。因此，改善大豆苷元的水溶性，對提高其生物利用度、開發其藥用價值等均具有重要意義。

環糊精（Cyclodextrin， CD） 是直鏈淀粉在環糊精糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀寡糖的總稱，通常含有6～8個D（+）吡喃葡萄糖單元，分別稱為α， β和γ環糊精。環糊精具有“內疏水、外親水”的截錐狀分子結構，能與眾多有機/無機分子通過多種非共價相互作用，如范德華力、氫鍵作用、疏水作用等形成水溶性的主客體包合物或組裝成復雜的超分子體系。當將環糊精作為超分子主體應用于難溶藥物或生物活性分子時，可大大提升其水溶性、穩定性和生物利用度等性質[20～22]。

本實驗室近年致力于以環糊精為主體的天然藥物超分子體系研究[23～27]，發現用氨基等基團修飾β環糊精后，可極大地提升其水溶性。本研究以兩種氨基修飾的β環糊精衍生物（ACD） ，即單6氨基β環糊精（NCD） 和單6乙二胺基β環糊精（ENCD） 為主體，采用飽和水溶液法分別制備了它們與大豆苷元的固體包合物，優化了包合條件，通過X射線粉末衍射（XRD） 和熱重（TG） 分析等手段對它們進行了表征，采用熒光光譜法確定了包合平衡常數和包合比，同時對包合物的水溶性進行測試。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu RF5301PC熒光分光光度計（日本島津公司）； D/Max3B X射線衍射儀（日本理光公司）； NETZSCH STA449F3同步熱分析儀（德國耐馳公司） 。

大豆苷元（純度>98%，阿拉丁試劑） 、β環糊精（食品級，98%，孟州華興） 為直接購買使用，NCD和ENCD為參考本實驗室已有方法[28，29]自制。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 大豆苷元與氨基修飾β環糊精固體包合物的制備 在室溫（25℃） 及避光條件下，取大豆苷元76 mg（0.3 mmol） 溶于5 mL無水乙醇中，同時按一定比例取氨基修飾β環糊精溶于20 mL蒸餾水（pH≈7.0） 中，混合兩種溶液。室溫避光攪拌一定時間之后，減壓蒸去體系中的溶劑，再加少量水溶解。過濾除去其中的不溶固體，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到澄清濾液。減壓蒸干后， 于40℃真空干燥24 h，即得到固體包合物。通過對大豆苷元與氨基修飾β環糊精的投料比及攪拌時間的優化，以固體包合物的產率為指標獲取兩種固體包合物形成的最佳條件。

2.2.2 XRD分析 分別取大豆苷元、NCD、ENCD及它們的固體包合物作X射線粉末衍射分析。測試條件為：Cu靶，Kα輻射源（k=1.5460 ） ，電壓為40 kV，電流為100 mA，掃描速率為5°/min。

2.2.3 熱力學性能測試 對大豆苷元、NCD、ENCD及它們的包合物進行了熱性質研究。熱分析條件為：氮氣流速為70 mL/min，升溫速率為10℃/min，并由室溫升到400℃。

2.2.4 熒光光譜滴定 采用熒光光譜滴定法測定大豆苷元與β環糊精衍生物的包合穩定常數KS。首先，配制Na2CO3NaHCO3緩沖溶液（pH 10.5） ，并用其配制0.01 mol/L氨基修飾β環糊精溶液及3.0×105 mol/L大豆苷元溶液。取8支10 mL比色管，分別加入大豆苷元溶液1.0 mL，然后依次加入氨基修飾β環糊精溶液0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0， 1.2， 1.5和2.0 mL。所有待測比色管均用緩沖溶液定容至10 mL，室溫下超聲30 min后，在λex/λem = 385/468 nm波長下測定。

2.2.5 水溶性測試 采用飽和水溶液稱重法來進行包合物的水溶性測試。分別在2 mL蒸餾水（pH≈7.0） 中加入過量固體包合物，25℃避光劇烈攪拌1 h。濾紙過濾除去不溶固體后，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液減壓蒸干，稱重，以此計算包合物在水中的溶解度。

3 結果與討論

3.1 大豆苷元/NCD固體包合物的制備

在大豆苷元/NCD固體包合物的制備過程中，大豆苷元與NCD的投料比（大豆苷元∶NCD，摩爾比） 及包合攪拌時間對生成包合物的收率有一定的影響。 實驗結果表明：隨著攪拌時間延長，收率隨之提高，且至72 h時基本達到平衡，此時繼續延長攪拌時間對提高收率不再起作用，這時包合脫包的可逆過程基本達到平衡。此外，隨著投料比的增加，收率也隨之增加。當大豆苷元與NCD的投料比為3∶1時，收率基本趨于平衡，此時繼續提高投料比也不會導致收率的明顯變化。因此，經篩選確定該包合物制備的最佳條件為：大豆苷元與NCD的投料比為3∶1，包合時間為72 h，此時收率為83%。具體的投料比和攪拌時間對包合物回收率所產生的影響如表1所示。

3.2 大豆苷元/ENCD固體包合物的制備

與大豆苷元/NCD固體包合物的制備過程相似，包合攪拌時間和投料比這兩個因素同樣對大豆苷元/ENCD固體包合物的收率產生明顯影響。實驗結果表明，隨著攪拌時間的延長，產率隨之提高，且當攪拌時間為72 h時，收率達到最大；隨著投料比的增加，收率也隨之增大。當大豆苷元與ENCD的投料比為3∶1（n/n） 時，收率達到最大。因此確定包合物制備的最佳條件為：大豆苷元與環糊精投料比為3∶1（n/n） ，包合時間為72 h時，產率為67%。具體的條件篩選過程如表2所示。

3.3 XRD分析

采用XRD分析對大豆苷元在形成包合物前后的晶體/非晶體形態進行了表征。圖2為大豆苷元、NCD、ENCD及它們之間的兩種固體包合物的XRD圖譜。從圖2可見，大豆苷元本身呈現典型的晶體形態（a） ，而兩種氨基修飾β環糊精NCD和ENCD均為無定形態粉末（b和d） 。而在形成包合后，兩種包合物均不再表現出大豆苷元的晶體形態特征，而是更多地呈現與其主體（NCD和ENCD） 相似的無定形態特征。通常，環糊精如與另一組分只形成簡單的物理混合物時，其XRD分析結果將呈現兩者圖譜的簡單加合。因此，該變化可初步證明大豆苷元與氨基修飾β環糊精之間形成了主客體包合物，而非物理混合物。

3.4 包合物的熱力學性能

通過熱重（TG） 分析對大豆苷元形成包合物前后的熱力學性質的改變進行了探討。圖3記錄了大豆苷元、NCD、ENCD及兩種固體包合物的TG曲線，大豆苷元在308.82℃開始分解（曲線a） ，NCD在303.25℃開始分解（曲線b） ，而大豆苷元/NCD包合物在296.83℃開始分解（曲線c） ，即形成包合物后分解溫度較大豆苷元和NCD均有所降低。另一方面，ENCD的分解溫度為272.91℃（曲線d） （其中向上的尖峰應為儀器誤差） ，而與大豆苷元形成包合后，包合物的分解溫度降至245.04℃（曲線e） 。從包合前后主、客體及包合物之間熱重曲線的明顯區別可進一步證實大豆苷元與兩種氨基修飾β環糊精均形成了包合物。

3.5 包合比的確定

以Na2CO3NaHCO3緩沖溶液（pH 10.5） 配制大豆苷元分別與NCD和ENCD的混合溶液。保持大豆苷元與氨基修飾β環糊精的總濃度不變（3.0 × 105 mol/L） ，使大豆苷元在其中的物質的量的比率在0.1～0.9變化。通過測定它們的熒光強度變化獲得Job′s曲線（圖4） ，進而得到大豆苷元的兩種包合物的包合比。由圖4可見，從曲線中最高點所對應的橫坐標（0.5） 可知，大豆苷元與兩種氨基修飾β環糊精的包合化學計量比均為1∶1，此結果與本研究組之前的研究結果[30]一致。

3.6 包合穩定常數的測定

NCD和ENCD與大豆苷元的混合溶液的熒光光譜曲線如圖5所示。熒光光譜曲線均是以Na2CO3NaHCO3緩沖溶液（pH 10.5） 為介質而測得，檢測波長為：λex/λem=385/468 nm。

由于大豆苷元與NCD和ENCD的包合比均為1∶1，所以其包合穩定常數Ks滿足公式（1） ：

KS： 包合穩定常數（L/mol）；[CD]0和[CD]分別為環糊精的初始濃度及環糊精濃度（mol/L）； [Daidzein]0和[Daidzein]分別為大豆苷元的初始濃度及大豆苷元濃度（mol/L）； [CD·daidzein]：環糊精/大豆苷元包合物的濃度（mol/L）；ΔF： 大豆苷元熒光強度的變化；Δε： 有無環糊精時大豆苷元的摩爾消光系數差值。

由此可推出公式（2） ：

其中，ΔF可以根據實驗中環糊精濃度改變測得的熒光強度差值計算得到，然后根據非線性最小二乘法計算得到包合物的KS值。表3給出了兩種包合物包合穩定常數KS及吉布斯自由能變化ΔG，兩種氨基修飾β環糊精對大豆苷元的包結能力NCD>ENCD，這與兩者在同一條件下的包合收率大小一致（83%和67%） ，表明包合能力的強弱可能影響氨基修飾β環糊精與同一客體形成包合物的收率。

3.7 包合物的水溶性

通過飽和水溶液法測試表明，大豆苷元與NCD及ENCD形成包合物后，在水中的溶解度分別提高至15.2和13.2 mg/mL（以大豆苷元的質量計算） ，相對于同樣條件下大豆苷元本身的溶解度（8.31 μg/mL） 分別提高了約1800和1500倍。與此同時，與文獻報道的β環糊精常見衍生物如2羥丙基β環糊精（HPβCD） [30，32]、磺丁基醚β環糊精（SBEβCD） [31]以及β環糊精[32]等相比，本研究所使用的兩種氨基修飾β環糊精對大豆苷元具有更強的增溶能力（見表4） 。

實驗結果表明，利用飽和水溶液法制備的大豆苷元與兩種氨基修飾β環糊精NCD和ENCD的固體包合物，均可明顯提高大豆苷元的水溶性，形成包合物后，大豆苷元在水中的溶解度分別提高了約1800和1500倍，對大豆苷元的增溶能力強于已報道的環糊精及其衍生物。這些實驗結果可為設計和開發新的大豆苷元的水溶性制劑提供新的研究思路。

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