一種聚丙烯酸接枝型熒光納米粒子的制備、性能及細胞成像

廖曉燕+梁淑彩+劉羽萍+張靜雅+鄢國平

摘 要 將N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亞胺（AMN）通過酰胺化反應接枝到聚丙烯酸鏈上，利用生成的聚合物在水溶液中的自組裝， 制備了一種水溶性熒光納米粒子（PAAMN）。采用紫外可見光譜、核磁共振氫譜、透射電鏡、動態光散射和熒光光譜方法對PAAMN進行了表征，MTT法檢測其細胞相容性，最后用熒光顯微鏡觀察其自身熒光及細胞成像效果。實驗結果表明， PAAMN為球狀結構，萘酰亞胺熒光團的摩爾取代度為4.1%； 在生理pH條件下，以390 nm為激發波長，PAAMN在534 nm處發射較強的熒光，且光穩定性較好； 在pH 4.0～10.0范圍內，其熒光波長無明顯變化，熒光強度隨pH值增大而逐漸減小，但pH敏感程度小于AMN。PAAMN具有良好的細胞相容性，能進入細胞，且在～390 nm激發光下發射綠色熒光，可用于細胞成像。

關鍵詞 熒光納米粒子； 聚丙烯酸； 萘酰亞胺； 自組裝； 細胞成像

1 引 言

熒光納米粒子是一類重要的納米功能材料，在細胞成像、疾病診斷及生物傳感等領域有廣闊的發展前景[1，2]，而具有良好水溶性、光穩定性及低毒性是其在這些領域中應用的前提。目前，基于無機材料的熒光納米粒子研究較為廣泛，如無機半導體量子點[3]、碳量子點[4]和金納米粒子[5]等，這些納米粒子常需要通過表面修飾或者聚合物包覆來提高其水溶性、可修飾性、生物相容性等特性。相對于無機熒光納米粒子，有機聚合物熒光納米粒子在結構多樣性和功能可設計性方面具有明顯優勢，近年來引起了研究者的興趣[6～10]。聚合物納米粒子中熒光團的存在形式主要有兩種[11，12]： 一種是非共價結合，如在納米粒子制備過程中或者制備完成后，通過包埋或吸附方法負載熒光團； 另外一種是共價鍵合，如通過表面修飾方式將熒光團鍵合到無熒光的納米粒子上，或先制備熒光聚合物單體，再聚合形成納米粒子。利用生物相容性兩親聚合物的自組裝對熒光團進行包裹是制備熒光聚合物納米粒子的常用方法[11，13，14]，該方法簡單，得到的納米粒子水分散性及生物相容性良好，但由于熒光團以非共價方式結合，在使用過程中容易泄露。采用先將熒光團與聚合物共價結合再進行自組裝的方法可以減少或避免染料泄露問題，有效提高熒光納米粒子的穩定性，目前該類水溶性熒光納米粒子的研究報道較少[15～17]。

聚丙烯酸（PAA）是一種常用高分子材料，在化工、紡織、水處理、食品、醫藥等領域應用廣泛[18，19]。由于PAA無毒、易溶于水，且富含可功能化的羧基，近年來被研究者用于無機納米粒子的修飾制備有機無機復合納米材料[20，21]、與共價聚合物進行自組裝制備水溶性熒光納米粒子[22]、作為兩親聚合物的親水鏈段制備納米膠束[23]、進行交聯制備納米凝膠[24]等研究。本研究采用1，8萘酰亞胺熒光化合物N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亞胺（AMN）對PAA進行接枝改性，制備了兩親性的熒光聚合物，并利用該聚合物在水溶液中的自組裝得到了一種新的熒光納米粒子（PAAMN）； 對其形態、結構及熒光特性進行了表征，并考察了其細胞毒性及細胞成像能力。結果表明，此納米粒子具有好的水溶性、光穩定性和細胞相容性，可進入細胞并發射綠色熒光，在細胞成像方面有良好應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Bruker AV400型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）； UV2550型紫外分光光度計（日本島津公司）； 320S型pH計（梅特勒托利多儀器有限公司）； F4600型熒光分光光度計（日本日立高新技術公司）； JEM100CXII型透射電鏡TEM（日本電子株式會社）； IX51型倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會社）； ST360型酶標儀（上海科華生物工程股份有限公司）； Zetasizer Nano ZEN3600型動態光散射納米激光粒度儀（英國Malvern公司）。

AMN的合成見文獻[25]； 聚丙烯酸（PAA， 分子量2.6萬，河南凱特化工有限公司）； Gibco胎牛血清及DMEM培養基（Invitrogen公司）； 3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Sigma公司）； HeLa細胞為實驗室傳代培養； 其它試劑均為市售分析純； 實驗用水為去離子水。

2.2 PAAMN的制備

將0.5 g PAA，0.63 g EDAC·HCl和0.79 g NHS溶于10 mL DMF中，在室溫下攪拌反應1 h，向其中加入含AMN的DMF溶液，并于60℃攪拌反應4 h。將反應液離心，上清液放入透析袋中，在pH 3～4的稀HCl中進行透析。透析一段時間后將袋內膠狀固體取出，溶解在pH 11的NaOH溶液中，滴加稀HCl使其析出。經過多次堿溶酸沉處理后，將該固體溶解，再于水中透析，測試透析液熒光強度。當透析液熒光強度為零時，將透析袋內溶液取出， 凍干， 得目標產物（PAAMN）。

2.3 PAAMN的形態及結構表征

將納米粒子溶液滴在含有Formar膜的銅網上，并進行負染，采用TEM觀察其形態； 采用納米激光粒度儀測定PAAMN在水溶液中的粒徑； 用DMSOd6+D2O為溶劑測定PAAMN的1H NMR光譜。

將AMN溶于乙醇中，配成1.0 mg/mL儲備液，再用水稀釋得所需濃度的工作溶液。將PAAMN用水溶解， 配制成2.0 mg/mL儲備溶液，并用水稀釋至所需濃度的工作溶液。分別測定AMN及PAAMN工作溶液的紫外可見吸收光譜； 在392 nm下測定不同濃度AMN溶液的吸光度并繪制標準曲線。根據PAAMN溶液在392 nm處的吸光度和AMN的標準曲線，按文獻[25]的方法計算納米粒子中熒光團的摩爾取代度。

2.4 熒光性質研究

熒光光譜及量子產率測定： 測定水溶液中PAAMN及AMN的熒光光譜； 以硫酸奎寧為參比，測定水溶液中PAAMN及AMN的熒光量子產率，硫酸奎寧在0.05 mol/L H2SO4溶液中的量子產率按0.55計算[26]。

光穩定性考察： 以390 nm為激發波長，534 nm為發射波長，每隔5 s測定一次PAAMN溶液的熒光，觀察2.5 h內熒光強度的變化。

金屬離子對PAAMN熒光的影響： 分別移取PAAMN的工作溶液0.1 mL和Ph 7.4的磷酸鹽緩沖溶液5.0 mL加入到10.0 mL比色管中，再加入金屬離子； 以不加金屬離子的PAAMN體系作為對照。各溶液用水定容后測定熒光光譜，記錄熒光強度。

pH值對PAAMN熒光的影響： 分別移取PAAMN及AMN的工作溶液0.1 mL加入到10.0 mL比色管中，用不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液定容后測定熒光光譜，記錄熒光強度。

2.5 MTT法檢測細胞相容性

將對數生長期的HeLa細胞按每孔5000個細胞接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM為培養基，在37℃含5%CO2的培養箱中培養。待細胞貼壁后，吸去板內培養基殘液，加入含不同濃度PAAMN 的培養液， 置于培養箱中孵育24 h，此后向每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續孵育4 h。然后移去板內液體，每孔加入200 μL DMSO，將細胞培養板放置搖床上， 低速振蕩使結晶物充分溶解。 用酶標儀在490 nm波長處測量各孔的吸光度（A）。以未加PAAMN的細胞作空白對照，計算細胞的相對增殖率（Relative growth rate，RGR）： RGR = （A實驗組/A空白對照組）×100%。

2.6 納米粒子及染色細胞的熒光顯微成像

納米粒子的熒光觀察： 將0.1 mg/mL PAAMN溶液用PBS溶液（pH7.4）稀釋10倍，然后取0.1 mL置于24孔培養板中，于熒光顯微鏡下觀察。

細胞染色及成像： 將HeLa細胞接種于24孔培養板中，待細胞貼壁后，移去原培養基，加入含0.01 mg/mL PAAMN的新培養基，并置于CO2培養箱中于37℃下培養2 h。然后移除培養基，用PBS溶液將細胞洗滌3次，再加入4%的多聚甲醛固定細胞，最后用熒光顯微鏡觀察細胞成像效果。

3 結果與討論

3.1 PAAMN的制備與表征

PAAMN 的制備方法如圖1所示。PAA中的羧基被活化后與AMN中的氨基反應，形成接枝聚合物； 該聚合物在透析過程中發生自組裝形成納米粒子，未反應的熒光團和溶劑也在透析中除去。將透析純化后的納米粒子溶液凍干，得到PAAMN。固體PAAMN能溶解于水中形成黃色透明溶液。

采用TEM、動態光散射（DLS）、UVVis 及1H NMR方法對納米粒子的形態及結構進行了表征。TEM圖如圖2A所示， 納米粒子呈規則球狀顆粒； 如圖2B所示，DLS測定PAAMN的水合粒徑約為290 nm。

圖3為AMN和PAAMN的UVVis光譜， AMN的最大吸收峰在392 nm，PAAMN的最大吸收峰在394 nm。1H NMR測定表明，PAAMN在7.00～8.77 ppm處有明顯的芳環氫相關信號，且在2.5～3.0 ppm處有哌嗪環上亞甲基的相關信號（圖4）。由于PAA在300 nm以上無明顯的吸收峰，其結構中不存在芳環，而納米粒子中未與PAA鍵合的熒光團已通過透析除去，因此上述結果證明萘酰亞胺熒光團已經被固定于PAAMN中。經計算，熒光團的摩爾取代度為4.1%，說明PAA中僅有部分羧基被取代，生成的納米粒子中仍有大量可修飾的羧基存在，為其進一步功能化提供了條件。

3.2 熒光性質

由AMN和PAAMN的熒光激發和發射光譜（圖5）可見，PAAMN具有與AMN類似的特征熒光光譜，它們的最大激發和發射波長均分別為390和534 nm，說明PAAMN的熒光是由萘酰亞胺熒光團產生，且與PAA鏈鍵合對熒光團的熒光波長無明顯影響。水溶液中PAAMN和AMN的量子產率測定結果分別是0.14和0.08，說明形成納米粒子增強了萘酰亞胺熒光團的熒光。在設定的測試條件下，2.5 h內測定PAAMN的熒光強度變化在7%以內（圖6），說明其有較好的光穩定性。

金屬離子對PAAMN熒光強度影響的實驗結果表明，在生理pH條件下，1.0106 mol/L的Mg2+，Hg2+，Ni2+，Mn2+，Al3+，Zn2+，Ba2+，Ag+和Cd2+對PAAMN的熒光沒有明顯影響ex=390 nm； em=534 nm.

由于許多4氨基萘酰亞胺衍生物對pH敏感[27，28]，因此本研究進一步考察了pH值對PAAMN熒光性質的影響。 結果表明，在pH 4.0～10.0范圍內，PAAMN的最大激發和發射波長不隨pH值變化而變化，但熒光強度隨著pH值增大而逐漸減小。如圖7所示，PAAMN的這種pH調控熒光分子開關功能與AMN類似，但熒光強度變化趨勢及范圍要小于AMN。造成上述現象的原因可能是[28，29]： 堿性條件下，萘酰亞胺類化合物哌嗪基團中的烷基胺作為電子給體，向萘酰亞胺進行光致電子轉移（PET），從而淬滅萘酰亞胺的熒光； 酸性增加使哌嗪基上的氮原子發生質子化，抑制了PET過程，因此熒光強度增強； 與AMN相比，PAAMN中有較多的羧基，對哌嗪上氮原子的質子化具有一定的緩沖作用，因此其熒光強度隨pH值變化相對較小。

3.3 細胞相容性

用于生物樣品的納米材料應具有良好的生物相容性。細胞毒性試驗是體外評價納米材料生物相容性的常用方法，具有經濟、快速、操作方便等優勢。本實驗采用MTT法考察了PAAMN濃度（0.001～0.25 mg/mL）對HeLa細胞增殖的影響，并根據美國藥典中RGR與細胞毒性分級的關系（RGR≥100%為0級； 80%～99%為Ⅰ級； 50%～79%為Ⅱ級； 30%～49%為Ⅲ級； 0～29%，Ⅳ級）對其毒性進行評級。從圖8可見，在測定的濃度范圍內，當PAAMN濃度低于0.1 mg/mL時，細胞的RGR均大于90%； 隨著PAAMN濃度增加，RGR略有下降，但都大于80%。各測試濃度PAAMN對HeLa細胞的毒性反應分級均為Ⅰ級，說明PAAMN具有良好的細胞相容性。

3.4 熒光成像

PAAMN溶液的熒光顯微成像如圖9A所示，在390 nm激發光下，PAAMN能發射綠色的熒光。由于PAAMN具有好的細胞相容性，且在生理條件下具有較強的熒光，因此進一步考察了其用于細胞成像的可行性。

HeLa細胞在含0.01 mg/mL PAAMN的培養基中孵育，然后洗去多余的納米粒子，將細胞固定， 在390 nm激發光下觀察成像效果，結果如圖9B所示，染色后的細胞仍具有較好的形態， 發出綠色熒光，表明PAAMN在細胞成像方面具有應用潛力。

4 結 論

本研究以具有良好生物相容性及水溶性的PAA聚合物為基礎， 進行萘酰亞胺衍生物接枝改性，并將生成產物自組裝制備了球形的納米粒子。該納米粒子具有好的水溶性，熒光團以共價鍵的方式固定于其中，不易泄漏， 其在生理條件下具有較強的熒光＼，較長的熒光發射波長（>500 nm）＼，大的Stocks位移（144 nm）以及良好的光穩定性和細胞相容性。熒光顯微成像表明，合成的熒光納米粒子能進入細胞，且在390 nm激發光下發射綠色熒光，可用于細胞熒光成像。由于具有大量可用于修飾的羧基，對其進行結構修飾還有望制成高靈敏度和選擇性的熒光探針，在樣品檢測及生物成像研究中有應用潛力。

Reference

1 Yao J， Yang M， Duan Y X. Chem. Rev.， 2014， 114： 6130-6178

2 Ng S M， Koneswaran M， Narayanaswamy R. RSC Adv.， 2016， 6： 21624-21661

3 Volkov Y. Biochem. Bioph. Res. Co.， 2015， 468（3）： 419-427

4 Kozák O， Sudolská M， Pramanik G， Cígler P， Otyepka M， Zboǐil R. Chem. Mater.， 2016， 28（12）： 4085-4128

5 YANG YuDong， LIU GongZhao， LI DongZhi， XU JingHua， YANG LinMei. Chin. Sci. Bull.， 2015， 60： 817-829

楊玉東， 劉公召， 李冬至， 徐菁華， 楊林梅. 科學通報， 2015， 60（9）： 817-829

6 Li K， Liu B. Chem. Soc. Rev.， 2014， 43： 6570-6597

7 HUANG ChiBao， CHEN HuaShi， ZENG BoPing， CHEN XiaoYuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（4）： 507-511

黃池寶， 陳華仕， 曾伯平， 陳曉遠. 分析化學， 2015， 43（4）： 507-511

8 Luk B T， Zhang L F. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2014， 6： 21859-21873

9 XIE LiJuan， CHEN Zhuo. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， （11）： 3051-3055

解麗娟， 陳 卓. 光譜學與光譜分析， 2014， （11）： 3051-3055

10 WANG Sheng， QIU Na， ZHANG PengChao， TANG Kun， ZHANG FuLi. Chinese J. Appl. Chem.， 2016， 33（1）： 32-38

王 升， 邱 娜， 張鵬超， 湯 昆， 張付利. 應用化學， 2016， 33（1）： 32-38

11 Robin M P， O′Reilly R K. Polym. Int.， 2014， 64（2）： 174-182

12 GarciaAmorós J， Tang S， Zhang Y， Thapaliya E R， Raymo F M. Top. Curr. Chem.， 2016， 370： 29-60

13 Hamon C L， Dorsey C L， zel T， Barnes E M， Hudnall T W， Betancourt T. J. Nanopart. Res.， 2016， 18： 207

14 KolitzDomb M， Grinberg I， CoremSalkmon E， Margel S. J. Nanobiotechnol.， 2014， 12： 30.

15 Yang K， Li S， Jin S， Xue X， Zhang T， Zhang C， Xu J， Liang X J. J. Mater. Chem. B， 2015， 3： 8394-8400

16 Liu M， Wang K， Zhang X， Zhang X， Li Z， Zhang Q， Huang Z， Wei Y. Tetrahedron， 2015， 71： 5452-5457

17 Wang K， Zhang X， Zhang X， Yang B， Li Z， Zhang Q， Huang Z， Wei Y. Colloids Surf. B， 2015， 126： 273-279

18 Russo E， Selmin F， Baldassari S， Gennari C G M， Caviglioli G， Cilurzo F， Minghetti P， Parodi B J. Drug Deliv. Sci. Tec.， 2016， 32： 113-125

19 Alhalawani A M F， Curran D J， Boyd D， Towler M R. J. Polym. Eng.， 2016， 36（3）： 221-237

20 Zhang S X， Xue S F， Deng J， Zhang M， Shi G， Zhou T. Biosens. Bioelectron.， 2016， 85： 457-463

21 Zhang Y， Han L， Hu L L， Chang Y Q， He R H， Chen M L， Shu Y， Wang J H. J. Mater. Chem. B， 2016， 4： 5178-5184

22 LU XiaoMei， FAN QuLi， ZHANG GuangWei， FU KanYi， HUANG Wei. Chem. J. Chinese Universities， 2010， 31（3）： 597-601

盧曉梅， 范曲立， 張廣維， 浦侃裔， 黃 維. 高等學校化學學報， 2010， 31（3）： 597-601

23 Chen S， Cheng S X， Zhuo R X. Macromol. Biosci.， 2011， 11： 576-589

24 Ghorbaniazar P， Sepehrianazar A， Eskandani M， NabiMeibodi M， Kouhsoltani M， Hamishehkar H. Adv. Pharm. Bull.， 2015， 5（2）： 269-275

25 YU Hui， LIANG ShuCai， ZHONG HaiDi， FU Ting， YAN GuoPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（3）： 409-413

余 慧， 梁淑彩， 鐘海迪， 付 婷， 鄢國平. 分析化學， 2011， 39（3）： 409-413

26 Brouwer A M. Pure Appl. Chem.， 2011， 83（12）： 2213-2228

27 Georgiev N I， Bojinov V B， Nikolov P S. Dyes Pigments， 2011， 88（3）： 350-357

28 Tian Y， Su F， Weber W， Nandakumar V， Shumway B R， Jin Y， Zhou X， Holl M R， Johnson R H， Meldrum D R. Biomaterials， 2010， 31： 7411-7422

29 Tian H， Gan J， Chen K， He J， Song Q L， Hou X Y. J. Mater. Chem.， 2002， 12： 1262-1267