光譜法研究哈巴俄苷與人血清白蛋白的結合反應

曹團武+周坤+黃文兵+時建偉+譚曉平+黃春林+冉嬡

摘 要 在不同溫度及模擬血液pH值條件下，采用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法研究了哈巴俄苷（Harpagoside， HAR）與人血清白蛋白（Human serum albumin， HSA）的結合反應。結果表明，HAR有規律地使HSA內源熒光猝滅，猝滅常數隨溫度升高而降低，其猝滅機制為兩者形成復合物而引起的的靜態猝滅； 不同條件下兩者結合常數KA均大于105 L/mol，結合位點數n≈1。由Van′t Hoff方程計算獲得了不同條件下HAR與HSA相互作用的熱力學參數，由ΔG、ΔH和ΔS均小于0可知，兩者結合的主要作用力是氫鍵和范德華力，且兩者結合是吉布斯自由能降低的自發過程。根據Frster非輻射轉移理論計，計算了不同條件下HAR與HSA的結合距離r在4.01～4.28 nm范圍內，表明兩者結合過程發生了非輻射能量轉移。同步熒光光譜表征結果表明，HAR使HSA的色氨酸和酪氨酸殘基所處的微環境極性增強，疏水性減弱，導致HSA構象發生了一定程度的改變。

關鍵詞 玄參； 哈巴俄苷； 人血清白蛋白； 熒光猝滅； 結合反應

1 引 言

中藥活性成分是中藥防治疾病的物質基礎。從細胞和分子水平研究中藥及其有效成分的作用機理，對中藥的深入研究與開發具有重要意義。藥物與生物大分子的相互作用研究，一直是藥理學、藥物化學、分子生物學等領域關注的熱點問題。現階段，在藥物與蛋白質相互作用研究方面，主要針對它們之間的結合部位、作用力、結合位點數、熱力學常數，以及由此引起的蛋白質構型變化等方面[1，2]。人血清白蛋白（Human serum albumin， HSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質，具有維持內生理環境相對穩定作用，可與藥物小分子結合，并將其運輸至身體的各個部位，是藥物發揮藥效和生理功能的重要載體和靶分子。應用多種光譜法獲得中藥有效成分與HSA相互作用的各種數據，進而分析兩者之間相互作用機理，對于揭示中藥藥理活性、進行藥物分子設計和開發及藥物的臨床應用等具有重要的指導意義[1～5]。

中藥玄參為玄參科（Scrophulariaceae）玄參屬（Scrophularia）植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結之功效[6～9]。哈巴俄苷（Harpagoside， HAR）為環烯醚萜類化合物，是玄參中的主要化學成分和藥理活性成分之一，現代藥理學研究表明，HAR苷具有抗炎、鎮痛、抗血小板聚集、保護血管內皮層細胞、保護神經元及提高免疫力等作用[10～14]。目前，關于HAR與HSA的結合反應研究未見報道。因此，本研究以HSA為模型蛋白，利用熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法研究HAR與HSA的結合作用機制，獲取了兩者相互作用的結合參數、結合位點數、作用力類型以及HAR對HSA構象的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F4500熒光光度計、UV4010紫外可見分光光度計（日本日立公司）； HH2數顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）； UPTII10T優普超純水器（四川優普超純科技有限公司）； PHS3C pH計（上海康儀儀器有限公司）； Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）。

哈巴俄苷（本實驗室從玄參中分離得到，NMR鑒定結構，HPLC鑒定純度>98%）用50%乙醇配制成1.0 × 103 mol/L儲備液，于4.0℃暗處保存，用時逐級稀釋至所需濃度； 人血清白蛋白（0.2 g/mL，批號為201511052，華蘭生物工程重慶有限公司），用0.05 mol/L 緩沖溶液TrisHCl（pH 7.40）配制成2.0×105 mol/L的儲備液4.0℃暗處保存，用時稀釋至所需濃度； 0.05 mol/L的TrisHCl緩沖溶液（pH=7.40）和0.04 mol/L BrittonRobinson緩沖溶液（BR，用0.2 mol/L NaOH調節至pH 4.0， 7.0和9.0）； 乙醇、三羥甲基氨基甲烷、乙酸、硼酸等試劑均為分析純； 實驗用水為超純水。

2.2 實驗方法

熒光光譜和同步熒光光譜：在10 mL定量比色管中加入1.0 mL緩沖溶液、2.0 mL 2.0 × 106 mol/L HSA、適量HAR，使HAR濃度分別為4.0＼， 6.0＼， 15＼， 30＼， 40＼， 50＼， 60＼， 70和80 μmol/L，用去離子水定容后，在24℃、37℃和50℃下恒溫水浴2 h（整個體系保持NaCl濃度為0.9%，以維持生理條件下的離子強度）。固定激發波長λex=280 nm，激發和發射狹縫均為5 nm，用1 cm石英比色皿在280～500 nm范圍內掃描HSA及HSAHAR體系的熒光光譜[15]。固定Δλ=60 nm和15 nm（Δλ=λem-λex），記錄HAR與HSA相互作用的同步熒光光譜； 在240～500 nm范圍內的掃描HAR與HSA相互作用的紫外光譜[15]。

紫外吸收光譜：在10 mL定量比色管中加入1.0 mL緩沖溶液、2.0 mL 20 μmol/L的HSA和HAR，用去離子水定容后，在24℃、37℃和50℃下水浴恒溫2 h。以相應溶液的空白為參比，在紫外可見分光光度計上，記錄HASHAR體系在250～500 nm范圍內的紫外吸收光譜（1 cm的石英比色池）。

3 結果與討論

3.1 熒光猝滅機制及猝滅常數

許多分子能通過與熒光物質相互作用（如激發態反應、分子重排、能量轉移、形成基態復合物及碰撞猝滅等）而使其熒光強度下降的現象，稱為熒光猝滅[16，17]。HSA的內源熒光主要來源于色氨酸殘基，當小分子與HSA結合，會使色氨酸殘基的微環境發生改變而使其熒光強度發生改變[15]。在HSA溶液中，隨著HAR不斷加入，其濃度不斷增大，同時HSA的熒光強度逐漸降低（圖1），表明HAR可以有效猝滅HSA的內源熒光。

靜態猝滅和動態猝滅。靜態猝滅主要是由于猝滅劑分子和熒光物質發生結合作用，形成了復合物而導致淬滅； 動態猝滅主要是由于熱運動和分子碰撞引起的。不同猝滅機制可以根據溫度對結合常數的影響及測定熒光壽命的方法區別[16，18]。

判斷體系的熒光猝滅機制，可對猝滅過程的實驗結果，按照SternVolmer方程[16]進行處理。

根據SternVolmer方程，用F0/F對[Q]作圖（SternVolmer曲線），呈一條直線（圖2），通過該直線的斜率可計算得到動態猝滅常數Ksv。在不同溫度和pH值條件下，根據SternVolmer曲線計算得到HAR對HSA的熒光猝滅常數（表1）。

通常，對于靜態猝滅，猝滅常數Ksv隨溫度的升高而減小； 而對于動態猝滅，猝滅常數Ksv隨溫度的升高而增大[19，20]。根據實驗數據所得計算結果（表1），HAR與HSA結合反應的動態猝滅常數Ksv隨著溫度的升高而減小，表明HAR對HSA的熒光猝滅機制為靜態猝滅。通常情況下，小分子猝滅劑對生物大分子的最大碰撞猝滅速率常數的閾值為2.0×1010 L/mol·s，如果計算所得的猝滅速率常數小于此閾值，表明為動態猝滅機理； 若猝滅速率常數大于此閾值，則猝滅過程可能包含了靜態猝滅過程[18]。由計算所得的數據（表1）可知，在不同條件下，HAR對HSA的熒光猝滅速率常數Kq值均遠大于最大碰撞猝滅速率常數的閾值，進一步說明了HAR對HSA的熒光猝滅機制為靜態猝滅。根據以上分析，HAR對HSA的熒光猝滅過程主要是由兩者之間結合形成復合物而引起的靜態猝滅。

3.2 結合常數和結合位點數

HAR對HSA的熒光猝滅機理主要為靜態猝滅。對于靜態猝滅過程，假設化學小分子Q在蛋白質分子上有n個獨立且等同的結合位點，小分子化合物與蛋白質大分子相互作用的結合常數KA及結合為點數n，可采用Scatchard方法，由公式（2）求出[20，21]。

lg[（F0-F）/F]=lgKA + nlg[Q]（2）

以lg[（F0-F）/F]為縱坐標，lg[Q]為橫坐標作圖，根據雙對數曲線的斜率和截距可以得到HAR與HSA相互作用的結合常數KA及結合位點數n。

在不同實驗條件下，HAR與HSA按照靜態猝滅形成復合物模型，通過實驗數據得到雙對數曲線（圖3）均呈良好的線性關系（線性回歸系數>0.99）。根據雙對數曲線計算得到HAR與HSA相互作用的結合常數KA在1.20 × 105～2.98 × 106 L/mol之間，表明兩者之間有較強的結合作用； 結合位點數n在1.09～1.44之間，數值接近于1，表明兩者可能形成一個結合位點（表2）。在不同溫度和pH值條件下，HAR與HSA相互作用的結合常數存在一定差異，說明體系的溫度和pH值對HAR與HSA的結合反應有影響。

3.3 相互作用的熱力學參數和主要作用力

化合物（包括藥物小分子）與蛋白質等生物大分子之間常借助氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水作用力等非共價結合形成超分子復合物。不同化合物與蛋白質結合的作用力類型不同，根據熱力學常數的符號與大小判斷作用力類型[4，22]。ΔG（自由能變）、ΔH（焓變）和ΔS（熵變）可通過Van′t Hoff方程[23]進行計算：

其中，KA為對應溫度下的結合常數，R為摩爾氣體常數，以lnKA對1/T作圖（圖4），由斜率和截距分別可以求出焓變ΔH和熵變ΔS，再由公式（4）可計算出不同條件下反應的吉布斯自由能變ΔG。 從熱力學角度看，在一定溫度和壓力下，化合物與蛋白質結合反應能否自發進行取決于體系的吉布斯自由能變ΔG，ΔG<0，有利于反應自發進行。根據反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，判斷化學小分子與生物大分子之間的主要作用力類型的規律：當ΔH>0、ΔS>0時， 為疏水作用力； 當ΔH<0、ΔS>0時，為靜電作用力； 當ΔH<0、ΔS<0時，為氫鍵和范德華力[24]。通過實驗數據計算了不同條件下HAR與HSA結合反應的熱力學常數（表2），結果表明：不同條件下HAR與HSA結合反應的自由能變ΔG均小于0，表明兩者結合過程是自發進行的； 熱力學焓變ΔH和熵HSA結合過程中氫鍵和范德華力是主要相互作用力。

3.4 結合距離

HSA有較強的熒光，且與HAR的吸收光譜有較大的重疊，作為給體（HSA）的熒光光譜和作為受體（HAR）的吸收光譜的重疊，可以說明兩者有一定程度的能量轉移。根據Frster非輻射能量轉移理論，當HAR在HSA上的結合位點與色氨酸的距離小于7 nm時，將發生非輻射能量轉移[4～5]。HSA熒光發射光譜與HAR吸收光譜間的光譜重疊（見圖5）積分J可由式（5）求得[23]：

其中， F（λ）為HSA在波長λ處的熒光強度， ε（λ）則為HAR在波長λ處的摩爾消光系數，J為重疊面積。

能量轉移效率E與HSAHAR結合距離r及臨界能量轉移距離R0有關，可由以下公式求得[21～23]：

其中， R0是指能量轉移效率E=50%時的臨界距離， K2為偶極空間取向因子（取值2/3）， N為介質的折射指數（取值1.336）， Φ為給體的光量子效率（取值0.118）。

依據公式（5）求得HAR紫外吸收光譜與HSA熒光發射光譜的重疊的積分J，再根據式（6）和（7）計算得HAR與HSA結合反應的R0，E、和r（表3）。結果表明，HAR與HSA反應的結合距離r為4.08～4.29 nm， 小于7 nm，且符合了0.5R0

3.5 HAR對HSA構象的影響

熒光光譜其最大發射波長的偏移與蛋白質氨基酸殘基周圍的微環境有關，同步熒光光譜可以提供關于蛋白質構象改變的信息。對于蛋白質的同步熒光光譜，Δλ=15 nm時只表現酪氨酸殘基的熒光； Δλ=60 nm時僅表現色氨酸殘基的熒光[19，24]。

固定HSA的量，隨著HAR濃度增大，酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光強度均發生明顯的猝滅（圖6）。隨HAR濃度增大，色氨酸殘基的發射峰波長有明顯的紅移，而酪氨酸殘基的發射峰波長在HAR濃度較高時有紅移現象，說明HAR的加入使HSA的構象發生了一定程度的改變，可能使色氨酸和酪氨酸殘基所處的微環境極性增強，疏水性減弱。

4 結 論

本研究采用熒光光譜結合紫外可見吸收光譜，在不同pH值和溫度條件下，研究了HAR與HSA的相互作用，獲得了兩者結合反應的熒光猝滅機制、結合常數、結合位點數、結合距離、作用力類型、構象變化等相關信息。結果表明，HAR對HSA的主要熒光猝滅機制為兩者形成復合物而引起的靜態猝滅，結合位點數為1，氫鍵和范德華力是兩者結合的主要相互作用力，兩者相互作用存在非輻射能量轉移，HAR使HSA的絡氨酸和色氨酸殘基周圍的微環境發生了一定改變。HAR與HSA有較強的結合常數，說明HAR能夠通過HSA被運輸到各個靶器官，進而產生藥理功效。