基于化學(xué)指紋圖譜和抗血小板聚集效價的丹參質(zhì)量評價

劉振杰+史志龍+王伽伯+張海珠+李春雨+牛明+何琴+甄漢深+肖小河

摘 要 通過化學(xué)分析和生物活性評價考察丹參藥材的品質(zhì)差異，探討丹參抗血小板聚集生物活性的主要貢獻成分。采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)建立丹參藥材HPLC指紋圖譜，以抗血小板聚集相對效價作為指標，評價不同產(chǎn)地不同批次丹參藥材的品質(zhì)差異，構(gòu)建基于化學(xué)表征及生物效價測定的評價模式。結(jié)果表明，不同批次丹參藥材的HPLC指紋圖譜相似度很高（相似度0.930～0.998），而其抗血小板聚集相對效價相差10倍，提示化學(xué)指紋圖譜難以反映丹參的活性和質(zhì)量差異。通過化學(xué)指紋圖譜與抗血小板聚集生物效價進行譜效相關(guān)分析，篩選出與生物活性相關(guān)系數(shù)大于0.5的6個色譜峰：二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及2個未知化合物。對上述4種已知化合物單體進行活性驗證發(fā)現(xiàn)，隱丹參酮的抗血小板聚集活性最強，而其它3種丹參酮類化合物幾乎沒有體外抗血小板聚集活性。進一步比較丹參中高含量成分丹酚酸B與低含量成分隱丹參酮的活性貢獻，結(jié)果表明，兩者的活性貢獻基本相當(dāng)，說明隱丹參酮是丹參中低含量高活性成分，對評價丹參質(zhì)量具有重要貢獻度。

關(guān)鍵詞 丹參； 抗血小板聚集； 指紋圖譜； 生物效價； 譜效相關(guān)； 質(zhì)量評價

1 引 言

隨著中藥質(zhì)量控制技術(shù)飛速發(fā)展，以化學(xué)標志物為核心的藥品標準和質(zhì)量檢驗檢測技術(shù)體系已達到發(fā)達國家水平，但尚未建立科學(xué)、嚴謹、低成本并符合中醫(yī)藥整體觀及中藥特點的中藥產(chǎn)品質(zhì)量保障體系。因此，需要盡快構(gòu)建具有中國特色的中藥技術(shù)規(guī)則，建立一個以臨床療效為導(dǎo)向，基于多環(huán)節(jié)、多指標、定量化、綜合性的中藥材評價控制方法體系，對中藥材品質(zhì)進行評價與控制，以期保證中藥安全性、有效性和質(zhì)量穩(wěn)定性[1]。中藥指紋圖譜能夠體現(xiàn)多組分中藥的化學(xué)表征，可以控制中藥的整體質(zhì)量[2，3]。然而其所體現(xiàn)的化學(xué)成分與藥效的相關(guān)程度尚不明確。因此，單獨利用指紋圖譜評價中藥質(zhì)量的優(yōu)劣還存在一定的局限性[4，5]。而將指紋圖譜與藥效進行相關(guān)性研究（譜效相關(guān)），不僅可以使指紋圖譜與其藥效相關(guān)聯(lián)，而且還能找到與活性密切相關(guān)的指紋圖譜峰，從而構(gòu)建對中藥質(zhì)量控制更有針對性的藥效指紋圖譜[6～9]。

最近，美國FDA發(fā)布《植物藥發(fā)展的工業(yè)指南（2015版）》，指出生物評價是中草藥和植物藥發(fā)展的一個重要方法[10]。生物評價（Biological assay， Bioassay），是指在特定的實驗條件下，評價供試藥物作用于生物體系（整體動物、離體組織、器官、微生物和細胞以及相關(guān)生物因子等）所表達出的特定生物效應(yīng)的方法，可用于定性或定量評價供試藥物的質(zhì)量[11]， 具有關(guān)聯(lián)功效的優(yōu)勢。將生物評價方法應(yīng)用于譜效相關(guān)中，可以使譜效關(guān)系更準確可靠[12]。

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[13]。丹參及相關(guān)制劑廣泛應(yīng)用于臨床，加強其質(zhì)量管理水平具有重要意義[14]。目前，丹參的指紋圖譜已用于丹參及相關(guān)制劑的品質(zhì)評價[15～17]； 丹參及其主要成分，特別是隱丹參酮的抗血小板聚集活性也有報道[18，19]。然而，隱丹參酮、丹酚酸B等成分及丹參藥材基于抗血小板聚集活性的相對效價未見報道，單體成分對丹參藥材品質(zhì)優(yōu)劣的貢獻度仍然未知，這些指標性成分與功能主治、藥效的關(guān)聯(lián)程度也不明確。因此，本研究在丹參化學(xué)指紋圖譜和抗血小板聚集效價的基礎(chǔ)上，經(jīng)過譜效相關(guān)分析，探討丹參抗血小板聚集生物活性的主要貢獻成分； 通過計算活性貢獻度的方法，揭示脂溶性成分與水溶性成分對丹參質(zhì)量評價的貢獻度，將更全面地反映其內(nèi)在質(zhì)量，以保證臨床用藥安全性和有效性。構(gòu)建的基于化學(xué)指紋圖譜和生物評價的綜合品質(zhì)評價方法， 可為丹參品質(zhì)評價提供參考，也為中藥炮制、藥材優(yōu)良品種選育、臨床處方選擇及制劑工藝優(yōu)化提供了新的評價模式。

2 實驗部分

2.1 丹參樣品采集

本研究共采集10批次樣品，產(chǎn)地包括：甘肅（S1）、河南1（S2）、河南2（S3）、河北1（S4）、山東（S5）、山西（S6）、河北2（S7）、陜西（S8）、河北3（S9）、四川（S10）。樣品經(jīng)肖小河研究員鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根莖。

2.2 儀器與試劑

AggRAM血小板聚集儀（美國Helena公司）； 1200高效液相色譜儀（美國 Agilent 公司）； Zorbax eclipse plus C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm， 美國Agilent公司）； 花生四烯酸（美國Helena Lab公司）； 阿司匹林（中國食品藥品檢定研究院）； 丹酚酸B、丹參素鈉、丹參酮ⅡA、丹參酮I、二氫丹參酮 I、隱丹參酮（成都普瑞法生物科技有限公司），以上對照品純度均大于98%。

2.3 實驗動物

雄性SD大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心），SPF級，體重240～260 g，動物許可證號：SCXK（軍）20120004。

2.4 化學(xué)指紋圖譜測定及分析

準確稱取丹參藥材粉末3.0 g，加入80%甲醇超聲提取，提取液經(jīng)微孔濾膜過濾，供HPLC分析。HPLC條件：進樣量5 μL，流速0.6 mL/min，檢測波長為285 nm。流動相為0.1% H3PO4 （A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～20 min，10%～28% B； 20～25 min，28%～48% B； 25～40 min，48%～60% B； 40～45 min，60%～10% B[15]。用《中國藥典》中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版計算相似度。應(yīng)用MetaboAnalyst 3.0軟件進行分析。

2.5 藥材生物效價測定

2.5.1 對照品溶液制備 準確稱取阿司匹林10.0 mg，加0.5% DMSO溶液500 mL，超聲溶解，制成0.02 mg/mL溶液， 并按劑間距1∶0.8稀釋成各個濃度的對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備 準確稱取丹參藥材粉末3.0g，加入80%甲醇提取，提取液濃縮得浸膏，稱取適量浸膏，加0.5% DMSO溶液，超聲溶解，制成丹參供試品母液，并按劑間距1∶0.8稀釋得到不同濃度的供試品溶液。

2.5.3 血漿制備 將大鼠腹腔注射0.12 mol/L戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，以0.13 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝，腹主動脈取血。100×g離心15 min，吸取上清液作為富血小板血漿（PRP），剩余部分以2000×g離心10 min，取上清液即為貧血小板血漿（PPP）。

2.5.4 血小板聚集率測定 取PRP175 μL加入測試杯，然后取50 μL PPP加入測試杯，37℃溫育，加入25 μL花生四烯酸，記錄血小板聚集曲線及空白血漿的最大聚集率。另取175 μL PRP加入測試杯，再加入供試品溶液50 μL，同法測定供試品的最大聚集率。

2.5.5 相對校價計算 抑制率（I，%）=（空白血漿的最大聚集率-供試品的最大聚集率）/空白血漿的最大聚集率。計算不同濃度的供試品與對照品（阿司匹林）的抑制率，參照《中國藥典》[20]和《藥品生物檢定》[21]“質(zhì)反應(yīng)平行線法”進行相對效價計算。

2.6 譜效相關(guān)

用MetaboAnalyst 3.0軟件系統(tǒng)進行Kendall分析[22]及SPSS軟件進行Spearman分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 化學(xué)指紋圖測定

10批次丹參藥材指紋圖譜見圖1A，相似度結(jié)果見表1。結(jié)果表明，10批次丹參藥材相似度在0.930～0.998之間，相似度非常高。然而，相似度是均等比較所有成分的綜合相似程度，如丹酚酸B就是丹參中高含量成分，其對指紋圖譜相似度影響最大，因此，通過指紋圖譜不易發(fā)現(xiàn)各批次丹參藥材之間的差異。本研究共選取17個共有峰，以峰面積進行熱圖分析，結(jié)果見圖1B，不同批次丹參藥材中除丹參酮類成分外化學(xué)成分變異不大。聚類結(jié)果（圖1B）中，批次4藥材單獨聚為一類，其丹參酮類化學(xué)成分為主要差異成分。而不同批次的藥材質(zhì)量是否存在差異，尤其是針對活血功效時丹參的品質(zhì)是否有差異，目前尚無明確定論，究其根本原因，是品質(zhì)評價方法的缺失造成的。

3.2 藥材生物效價測定

由相對效價計算結(jié)果（圖2）可知，本方法可以很好地區(qū)分不同批次丹參藥材的質(zhì)量差異，10批次藥材中，丹參抗血小板聚集的最高效價與最低效價相差10倍，提示化學(xué)指紋圖譜難以反映丹參的活性和質(zhì)量差異。

對10批次丹參藥材的17個色譜峰面積與抗血小板聚集效價進行Kendall相關(guān)分析及spearman相關(guān)分析，結(jié)果見圖3。其中12～17號峰與抗血小板聚集效價具有較高相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)大于0.5； 而具有顯著性相關(guān)的是12、13、15號峰，特別是13號峰，具有最大的相關(guān)系數(shù)。

3.3 單體化合物活性驗證

根據(jù)相關(guān)分析結(jié)果，結(jié)合文獻報道，推測活性相關(guān)系數(shù)較高的色譜峰的結(jié)構(gòu)[23]。經(jīng)過比對，12、13、14和16號色譜峰與對照品色譜峰保留時間一致，確定為二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA，而15和17號峰為未知化合物，見圖4A和4B。另外，計算丹參指紋圖譜峰的對稱因子、理論塔板數(shù)、分離度、選擇度，結(jié)果見表2，HPLC相關(guān)參數(shù)達到分離要求，確定色譜峰的分離效果良好，從而排除色譜峰中的其它雜質(zhì)成分干擾。

對已鑒定的化合物進一步驗證，結(jié)果見圖4C。隱丹參酮的抗血小板聚集抑制率為100%，而其它3個單體化合物在此濃度下沒有抑制作用。本研究中二氫丹參酮Ⅰ（12號峰）、隱丹參酮（13號峰）、丹參酮Ⅰ（14號峰）、丹參酮ⅡA（16號峰）都與抗血小板聚集的效價相關(guān)度較高，但驗證結(jié)果證明只有隱丹參酮（13號峰）有很強的抗血小板聚集作用（圖4C）； 因此，譜效相關(guān)的方法仍有一定缺陷，盡管應(yīng)用本方法能夠得出相關(guān)系數(shù)較高的成分，但不能排除多個成分之間伴隨相關(guān)的情況。為了排除伴隨相關(guān)/自相關(guān)的存在，應(yīng)將可辨識得到的單體化合物進行活性效價測定的驗證，也就是逐個地對化合物進行活性測定，以確定這些成分與效價之間是真實相關(guān)，還是伴隨相關(guān)。本研究對4種與藥效密切相關(guān)的成分進行了活性驗證，發(fā)現(xiàn)只有1種成分與藥效密切相關(guān)，為真實相關(guān)，其它3種成分是伴隨相關(guān)。

另外，測定并計算了丹參藥材中指標性成分的丹酚酸B和隱丹參酮的抗血小板聚集相對效價，測定方法同2.5節(jié)，結(jié)果見表2（相對效價）。結(jié)果表明，單體化合物相對效價之間存在一定的差異，隱丹參酮的相對效價為1628 U/mg，比丹酚酸B（37 U/mg）的相對效價高40倍，為阿司匹林的1.6倍。隱丹參酮為丹參中抗血小板聚集的藥效物質(zhì)，隱丹參酮抗血小板高活性功能的發(fā)現(xiàn)，為進一步開發(fā)抗血小板聚集的新藥的前體化合物提供可能[24]。隱丹參酮具有高活性的例子還發(fā)生在抑制血管新生，調(diào)節(jié)肝竇內(nèi)皮細胞功能上， 例如，隱丹參酮可以抑制體外血管生成，但丹參酮ⅡA卻沒有抑制作用[25，26]。

活性貢獻度即為指紋圖譜中活性成分的峰面積與此成分單體化合物的相對效價的乘積，由此可以出計算活性貢獻度，并比較丹參中高含量成分丹酚酸B與低含量成分隱丹參酮的活性貢獻，丹酚酸B和隱丹參酮的活性貢獻度分別為97779和90472，結(jié)果表明，兩者的活性貢獻基本相當(dāng)。因此，可以通過計算效應(yīng)成分指數(shù)的辦法[27，28]對中藥藥效成分進行活性校正， 以更好地綜合評控中藥質(zhì)量。

4 結(jié) 論

本研究通過測定不同批次丹參藥材的指紋圖譜，并結(jié)合其抗血小板聚集效價進行相關(guān)分析，構(gòu)建了基于化學(xué)指紋圖譜和生物評價的綜合品質(zhì)評價方法。此模式可以將中藥質(zhì)量評價與藥材的生物活性或臨床功效結(jié)合，不僅為多成分、多靶點的中藥品質(zhì)評價方法提供了參考依據(jù)，還可為中藥炮制、優(yōu)良品種選育、制劑工藝優(yōu)化及臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

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