基于氨基柱的高效液相色譜—示差折光檢測器方法分析媚麗葡萄香氣糖苷的糖基組成

汪興杰+張予林+劉吉彬+陶永勝

摘 要 建立了基于氨基柱的高效液相色譜分析媚麗葡萄香氣糖苷的糖基組成的方法。媚麗葡萄果皮經提取緩沖液（0.1 mol/L Na2HPO4NaH2PO4，pH 7.0，13%（V/V）乙醇）浸提，葡萄香氣糖苷提取物在檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）中用AR2000糖苷酶水解，釋放出糖基，經氨基柱分離，用高效液相色譜示差折光檢測器（HPLCRID）分析。色譜分析條件為：柱溫35℃，RID溫度35℃，進樣量20 μL，流動相為乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15，V/V），流速1.0 mL/min。結果表明，鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖和葡萄糖在線性范圍內線性關系良好（R2>0.996），檢出限為93～123 mg/L，定量限309～409 mg/L， 5 g/L各單糖的峰面積的精密度（n=10）為2.3%～6.4%； 糖基樣品的各單糖加標回收率在73.8%～125.7%之間。以糖基類別劃分的媚麗葡萄各類香氣糖苷的摩爾百分比為： 6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷，4.1%～6.1%； 6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷，2.3%～8.8%； 6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷，0.1%～3.9%； 6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷，5.5%～9.8%； 6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷，76.3%～86.8%。媚麗葡萄成熟過程中，各類香氣糖苷的含量及其總量與漿果成熟度之間沒有明顯的相關性。

關鍵詞 葡萄香氣糖苷； 糖基組成； 氨基柱； 高效液相色譜示差折光檢測器

1 引 言

香氣糖苷是一類由糖基和揮發性香氣成分（苷元）通過β糖苷鍵結合形成的香氣前體物質[1]。歐亞種釀酒葡萄（Vitis vinifera）中的香氣糖苷最早在亞歷山大玫瑰香（Muscat of Alexandrie）葡萄中發現[2]，并于1982年首次進行了結構鑒定[3]。研究發現，葡萄中香氣糖苷主要是二糖苷，單糖苷很少，三糖苷極少存在。香氣糖苷結構中與苷元直接連接的糖分子是葡萄糖，與葡萄糖相連的是鼠李糖、木糖、阿拉伯糖或芹菜糖等[4～6]。研究香氣糖苷水解后的糖基組成，對于準確推測香氣糖苷的結構，具有重要的理論意義和實際參考價值。此外，不同品種葡萄具有不同的香氣物質組成，分析香氣糖苷的糖基組成，是研究葡萄果實及其葡萄酒香氣特征的重要手段。香氣糖苷在酸解和酶促水解條件下會釋放出揮發性的香氣成分，通常采用氣相色譜（GC）進行香氣糖苷水解后游離成分的分離鑒定[7，8]，進而推測香氣糖苷的化學組成。液相色譜質譜聯用可以直接無損分析香氣糖苷[9，10]，但由于缺乏標準品以及受到其它糖苷的干擾，所鑒定香氣糖苷的化學類別和數量有限。雖然GC是目前香氣糖苷鑒定的主要方法，但水解過程很有可能伴隨目標香氣成分的分子重排，導致GC分析的誤差[11]。此外，葡萄香氣糖苷中糖基葡萄糖的含量占絕對優勢，糖苷水解后糖基分離的過程中，由于葡萄糖和其它干擾物的影響，采用色譜分離鑒定其它糖基難度較大，因此除含量最高的糖基葡萄糖外，香氣糖苷的其它糖基的研究鮮有報道[12～14]。

本課題組前期對釀酒葡萄新品種陜西楊凌“媚麗”（Vitis vinifera L. Meili）[15]釀造的媚麗葡萄酒的香氣成分[16，17]、感官質量[18]以及香氣糖苷的苷元[19]進行了初步研究。本研究采用高效液相色譜示差折光檢測器（HPLCRID）建立了基于氨基柱的香氣糖苷的糖基分析方法，揭示媚麗葡萄香氣糖苷的糖基組成，研究其與葡萄成熟度之間的聯系。本方法可對香氣糖苷進行定性與定量分析，為探討香氣糖苷的糖基與苷元的數量關系的研究提供了方法和參考數據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC10ATVP液相色譜儀、RID10A示差折光檢測器、CT010ASP柱溫箱（日本島津公司）； N2000色譜工作站（杭州憶捷科技有限公司）； TGL16M臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）； RE52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）； SPE12固相萃取裝置（北京開源國創科技有限公司）； SepPak C18固相萃取小柱（美國Waters公司）； Synergy純水制備儀（美國Millipore公司）。

L（+）阿拉伯糖（純度99%，德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司）； D芹菜糖（純度98%，百靈威科技有限公司）； D（+）葡萄糖、L鼠李糖、D（+）木糖（純度99%，上海源葉生物科技有限公司）。以上試劑均為色譜純。糖苷酶AR2000（250 U/g，荷蘭DSM Food Specialties 公司）。

媚麗葡萄于2015年采摘自陜西楊凌曹新莊（北緯34°18′，東經108°05′）葡萄園，采收時期8月16＼， 21、26、31日及9月5和11日。漿果含糖量為170～218 g/L，含酸量（以酒石酸計）為4.8～6.6 g/L。

2.2 葡萄香氣糖苷提取及酶解

香氣糖苷浸提、純化和酶解分別參照文獻[8，20，21]的方法，略有改動。葡萄果皮于緩沖液（0.1 mol/L Na2HPO4NaH2PO4，pH 7.0，13%（V/V）乙醇）中4℃避光浸提48 h。浸提液在4℃以10000 g離心30 min，35℃旋轉蒸發去除乙醇，用0.45 μm濾膜過濾，過C18固相萃取柱，C18柱先依次用二氯甲烷、甲醇、水各10 mL活化，上樣后，再分別用50 mL水、8 mL戊烷二氯甲烷（2∶1，V/V）淋洗，最后用8 mL乙酸乙酯甲醇（9∶1，V/V）洗脫香氣糖苷。香氣糖苷收集液于40℃旋轉蒸發至干，復溶于2 mL 檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 5.0），加入80 mg 糖苷酶AR2000，40℃水解16 h，得糖基樣品溶液。

2.3 液相色譜分析

2.3.1 糖標準液的制備 準確稱取葡萄糖、芹菜糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖的標準品各25.0 mg，用檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.0）配成5.0 g/L糖混合標準溶液（母液）。同時配制5.0 g/L單糖標準溶液，取適量母液進行倍比稀釋，用于建立單糖的標準曲線。

2.3.2 液相色譜分析條件 Agilent ZORBAX NH2氨基柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm， 美國Agilent公司），柱溫：35℃； RID溫度：35℃； 流速：1.0 mL/min； 進樣量：20 μL。流動相為乙腈乙酸乙酯水， 通過實驗確定最佳配比。

2.3.3 單糖組分鑒定及精密度實驗 5.0 g/L單糖標準溶液分別進樣，確定各單糖的保留時間，進行3次平行實驗。連續進樣10次，計算各單糖峰面積的相對標準偏差（RSD）值。

2.3.4 樣品測定及其組分鑒定 分別取適量樣品溶液及對照組溶液，過0.45 μm濾膜，液相色譜分析，重復測定3次。對比樣品中物質峰與單糖標準品的出峰時間，確定樣品中的糖基類別。

2.3.5 加標回收實驗 糖基樣品溶液與2 g/L混合糖標準溶液等體積混勻，過0.45 μm濾膜，進樣分析，重復測定3次。分別測定各個糖基樣品的初始各單糖濃度，以及加標后各單糖濃度，計算回收率。

3 結果與討論

3.1 方法學考察

3.1.1 流動相配比選擇 單糖標準品的高效液相色譜圖見圖1。結果表明，流動相為乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15，V/V）時，各單糖的分離效果最佳，色譜峰可以實現分離。而增加乙腈含量，降低乙酸乙酯含量，會使各峰分離度變小。因此，選擇乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15，V/V）為流動相進行分離。

3.1.2 線性關系、檢出限和精密度 通過倍比稀釋母液得工作溶液，建立單糖濃度與色譜峰面積的線性回歸方程，各濃度平行測定3次。以乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15， V/V）為流動相，高效液相色譜示差折光檢測器進行檢測，各單糖濃度與峰面積的線性關系良好，檢出限（LOD， S/N=3）為93～122 mg/L， 定量限（LOQ， S/N=10）為309～408 mg/L。5 g/L各單糖峰面積RSD在2.3%～6.4% （n=10）之間，精密度良好（見表1）。

3.1.3 加標回收率 不同時期的媚麗葡萄的糖基樣品的加標回收率（平均值±標準差（n=3））見表2，

3.2 媚麗葡萄香氣糖苷的糖基組成

糖基葡萄糖可以采用酸水解香氣糖苷的方式制備[13，14]，但是實際研究中酸水解溶液的pH值通常較低，易引起苷元的分子重排，甚至是糖基分子的變化。葡萄酒釀造環境條件下，有研究采用外源糖苷酶促進香氣前體物質的水解，進行增香釀造的嘗試[22]。 本研究采用AR2000糖苷酶進行香氣糖苷的水解，糖基樣品的液相色譜圖如圖2所示，AR2000對香氣糖苷的水解效果總體較好，HPLCRID方法能夠實現糖基的類別分析。樣品中檢測到的糖基類別為鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖和葡萄糖，與文獻[6]報道的葡萄香氣糖苷的糖基組成一致。

媚麗葡萄香氣糖苷的糖基含量（以葡萄果實質量換算，μg/g）如圖3所示，漿果成熟過程中葡萄糖基、各戊糖糖基及其總體含量呈無明顯規律的變化。糖基含量占糖基總量的百分比為：鼠李糖，1.88%～2.80%； 木糖，0.96%～3.73%； 阿拉伯糖，0.04%～1.26%； 芹菜糖，2.32%～4.17%； 葡萄糖，89.73%～94.28%。

釀酒葡萄的采收期的確定，常用糖酸比作為依據。圖3D是以糖酸比表示的媚麗葡萄的漿果成熟變化。糖酸比的不斷增大與糖基含量的無規律變化，表明媚麗葡萄香氣糖苷的各糖基含量及其總量與漿果成熟過程無明顯相關性，這也間接表明香氣糖苷的糖基組成與漿果成熟度之間沒有直接關系。不同香氣糖苷的含量變化情況不盡相同，香氣糖苷的積累與葡萄漿果的成熟度是相互獨立的[23，24]，并且香氣糖苷的含量變化與溫度有很大關聯[23]。所以，葡萄成熟期晴雨天的交替變化及溫度的升降變化都有可能影響香氣糖苷的糖基組成的含量變化。

葡萄香氣糖苷主要為雙糖苷，包括6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷[6]，而單糖苷僅發現含量較少的βD吡喃葡萄糖苷[5]。因為本研究檢測出以上糖苷分子中的全部單糖分子，

所以推測媚麗葡萄含有這5種香氣雙糖苷。戊糖參與形成的都是二糖苷[5，6]，因而戊糖苷的糖基葡萄糖與戊糖的摩爾數相同。以摩爾數計，5種香氣糖苷分別占香氣糖苷總量的比例見表3。Maicas等[5]研究了一些葡萄品種中以糖基劃分的香氣糖苷含量，發現香氣糖苷種類及其含量與葡萄品種有關，有些葡萄品種的果實中6OβD呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷約占總量的50%，6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷在6%～13%之間[5]。本研究采用摩爾百分比表示的媚麗葡萄香氣糖苷含量，含量最高的是6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷，占總量的76.3%～86.8%。其它香氣糖苷的摩爾百分比為：6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷，4.1%～6.1%； 6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷，2.3%～8.8%； 6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷，0.1%～3.9%； 6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷，5.5%～9.8%。除葡萄品種外，香氣糖苷的糖基組成與葡萄栽培地域的氣候、土壤，以及葡萄栽培模式、年份等因素是否相關，還需深入研究。

4 結 論

建立了葡萄果皮香氣糖苷的糖基類別的LCRID分析方法。在葡萄成熟期間，媚麗葡萄以糖基劃分的香氣糖苷的摩爾百分比分別為：6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷，4.1%～6.1%； 6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷，2.3%～8.8%； 6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷，0.1%～3.9%； 6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷，5.5%～9.8%； 6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷，76.3%～86.8%。媚麗葡萄成熟過程中各類香氣糖苷含量及其總量與漿果成熟度無明確相關性。

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