Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞毒性及caspase-3、α-2M基因表達(dá)的影響

郭慧, 朱曉聞, 歐榮華, 盧芷程, 譚翠婷, 申玉春, 朱春華

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524025)

Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞毒性及caspase-3、α-2M基因表達(dá)的影響

郭慧, 朱曉聞, 歐榮華, 盧芷程, 譚翠婷, 申玉春, 朱春華*

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524025)

本研究以Cu2+(0、100 μg·L-1)對(duì)羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii進(jìn)行處理，分別在脅迫后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h收集血淋巴，檢測(cè)血細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡率、活性氧(ROS)含量、酯酶活性、一氧化氮(NO)含量以及細(xì)胞凋亡執(zhí)行分子caspase-3和免疫因子α-2M基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，血細(xì)胞凋亡率和ROS含量的變化趨勢(shì)一致，在脅迫后的6～48 h顯著升高(P<0.05)。酯酶活性在脅迫后的3～48 h均顯著下降(P<0.05)，最低值出現(xiàn)在48 h。在脅迫后的6～48 h，NO含量持續(xù)增加，并與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。caspase-3的相對(duì)基因表達(dá)量在脅迫后的6～48 h均顯著升高(P<0.05)，并在24 h達(dá)到最高值。在脅迫后的12 h，α-2M基因的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)并達(dá)到峰值，在24 h有短暫降低，但與對(duì)照組相比仍顯著增加(P<0.05)，在48 hα-2M基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，血細(xì)胞凋亡率和NO以及ROS都呈顯著的正相關(guān)(P<0.001)。實(shí)驗(yàn)表明，Cu2+脅迫顯著抑制了機(jī)體的酯酶活性，誘導(dǎo)NO和ROS的產(chǎn)生以及免疫相關(guān)基因α-2M的表達(dá)來(lái)對(duì)抗Cu2+脅迫帶來(lái)的損傷。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)高濃度的NO和ROS對(duì)機(jī)體自身造成了傷害，并誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，說(shuō)明Cu2+對(duì)蝦類(lèi)具有免疫抑制性和毒性。NO和ROS的升高可能是細(xì)胞凋亡的主要誘因。

羅氏沼蝦； Cu2+； 血細(xì)胞毒性； 基因表達(dá)； 細(xì)胞凋亡

近年來(lái)，隨著我國(guó)工廠化和集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，水環(huán)境污染狀況日趨嚴(yán)重。在各類(lèi)環(huán)境污染物中，重金屬由于其遺傳毒性、持久性和不可降解性而備受關(guān)注(Wangetal.，2013)。Cu2+是甲殼動(dòng)物體內(nèi)必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，參與了多種生理過(guò)程，如血藍(lán)蛋白的合成、酶功能和組織完整性等(Bharadwajetal.，2014)。但是高濃度的Cu2+亦會(huì)對(duì)甲殼動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用(Santosetal.，2000；Valavanidis & Vlachogianni，2012)。在生產(chǎn)實(shí)踐中，Cu2+作為礦物營(yíng)養(yǎng)素、除藻劑或病原抑制藥物被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，其中的Cu2+沉淀積累在池塘中，對(duì)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了極大的威脅(Liaoetal.，2006)。據(jù)報(bào)道，在我國(guó)珠江口地區(qū)Cu2+的濃度處于污染水平，并具有一定的潛在生物毒性(Wangetal.，2015)。研究表明，Cu2+脅迫影響了對(duì)蝦的體色(Martínezetal.，2014)、存活和繁殖(Rao & Anjaneyulu，2008)，造成鰓和肝胰腺的組織損傷(Frías-Espericuetaetal.，2008)，增加了對(duì)病菌的易感性，降低其免疫功能(Yehetal.，2004)。當(dāng)蝦類(lèi)處于脅迫狀態(tài)時(shí)，其血細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡率、活性氧(ROS)含量、一氧化氮(NO)含量和酯酶活性都會(huì)發(fā)生改變(Xianetal.，2010，2013；Guoetal.，2013；郭慧等，2015)，因此可根據(jù)這些指標(biāo)的變化來(lái)判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮主導(dǎo)功能，α2巨球蛋白(α-2M)被認(rèn)為參與了蝦類(lèi)的先天性免疫，而目前關(guān)于Cu2+脅迫下羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii血細(xì)胞參數(shù)和caspase-3以及α-2M基因表達(dá)量的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文擬采用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，研究Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率、ROS含量、NO含量、酯酶活性以及caspase-3和α-2M基因表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步探究Cu2+脅迫對(duì)蝦類(lèi)毒性效應(yīng)提供參考。

羅氏沼蝦，又名大頭蝦、馬來(lái)西亞大蝦，是目前世界上養(yǎng)殖量最大的三大蝦種之一，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物，在水生態(tài)系統(tǒng)中分布較為廣泛，江河、湖泊等淡水和河口半咸水水域中均有分布，對(duì)水環(huán)境中各種理化性質(zhì)的變化反應(yīng)較靈敏(吳維福等, 2014)。因此，開(kāi)展重金屬Cu2+對(duì)羅氏沼蝦毒性效應(yīng)的研究具有重要的實(shí)踐意義，為水環(huán)境毒理學(xué)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用羅氏沼蝦購(gòu)自湛江某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為10.89 g±1.42 g，性成熟，非繁殖期。選取大小均勻、體色正常、附肢完整、活力強(qiáng)、無(wú)病患且處于蛻皮間期的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)。將羅氏沼蝦在實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)于溫度為26 ℃±2 ℃的淡水中2周，所有水質(zhì)指標(biāo)均符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》的要求(國(guó)家海洋局，1989)，暫養(yǎng)及脅迫實(shí)驗(yàn)期間24 h不間斷充氧。暫養(yǎng)期間每日06∶00和18∶00按蝦體質(zhì)量的2%投喂2次，脅迫實(shí)驗(yàn)前24 h停止喂食。

2’，7’-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)、DAF-FM DA購(gòu)自Sigma公司；二乙酸熒光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)、Annexin V FITC/PI(碘化丙啶)凋亡檢測(cè)試劑盒、總RNA提取試劑Trizol、瓊脂糖購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、rTaq PCR試劑盒、焦炭酸二乙酯(DEPC)、DL2000 Ladder Marker、熒光定量試劑盒(SYBR Green QPCR Super Mix-UDG)購(gòu)自TaKaRa公司；核酸染料EB替代物、PCR Premix Taq、DNA ladder、6×loading buffer購(gòu)自東盛公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，所用引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 脅迫實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和脅迫組，每組3個(gè)重復(fù)。根據(jù)前人研究(Chen & Wang，2001；Mahmoodetal.，2009)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置理論脅迫濃度為0(對(duì)照組)、100 μg·L-1(脅迫組)，用硫酸銅配置Cu2+溶液。將羅氏沼蝦置于塑料箱中，每桶25尾，脅迫組加入180 L硫酸銅溶液。每24 h換水50%。分別在脅迫后的0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h從每桶中隨機(jī)選取3尾(n=9)羅氏沼蝦，參照Guo等(2015)的方法收集血淋巴。

1.3 血細(xì)胞懸液的制備

用2 mL的一次性注射器吸取冰上預(yù)冷的抗凝劑(葡萄糖20.5 g·L-1，檸檬酸鈉8 g·L-1，氯化鈉4.2 g·L-1，調(diào)pH至7.5) 200 μL，然后從蝦的圍心腔抽取等量的血淋巴至1.5 mL離心管中，取200 μL用預(yù)冷的抗凝劑稀釋血細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/mL，用于流式細(xì)胞術(shù)指標(biāo)的檢測(cè)；余下的血淋巴在800 g、4 ℃離心10 min，棄上清，將血細(xì)胞重懸于Trizol中，-80 ℃保存，用于基因表達(dá)量分析。

1.4 流式細(xì)胞儀及參數(shù)設(shè)置

實(shí)驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD (Becton Dickinson)公司生產(chǎn)的FACSVerse，數(shù)據(jù)獲取和分析軟件為Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)。每個(gè)樣品均獲取10 000個(gè)細(xì)胞。異硫氰酸熒光素(FITC)、FDA、DCF、DAF用綠色熒光通道(第一熒光通道，F(xiàn)L1)獲取熒光數(shù)據(jù)。PI檢測(cè)用第二熒光通道(FL2)獲取熒光數(shù)據(jù)。

1.5 血細(xì)胞凋亡率

參照冼健安等(2015)的方法，以Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血細(xì)胞的凋亡率。取200 μL血細(xì)胞懸液，加入2.5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI工作液，輕輕震蕩混勻，避光染色15 min后加入50 μL 5×Annexin V結(jié)合緩沖液，200目篩網(wǎng)過(guò)濾后立即上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果以Annexin V-FITC和PI雙參數(shù)散點(diǎn)圖顯示，設(shè)門(mén)劃分細(xì)胞類(lèi)群：活細(xì)胞(Annexin V-FITC-/PI-)位于左下象限，前期凋亡細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI-)位于右下象限，后期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞(Annexin V-FITC+/PI+)位于右上象限。從樣品制備到上樣的整個(gè)過(guò)程應(yīng)控制在30 min以內(nèi)，以避免血細(xì)胞離體時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)結(jié)果造成不良影響。

1.6 ROS含量的測(cè)定

以DCFH-DA為標(biāo)記探針檢測(cè)ROS含量。取200 μL血細(xì)胞懸液，加入DCFH-DA工作液10 μL，混勻后避光孵育30 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 NO含量測(cè)定

以DAF-FM DA為標(biāo)記探針檢測(cè)NO含量。取血細(xì)胞懸液200 μL，加入10 μM的DAF-FM DA工作液，混勻后避光孵育60 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.8 酯酶活性

采用非特異脂溶性底物FDA進(jìn)行酯酶活性測(cè)定。取血細(xì)胞懸液200 μL，加入5 μM FDA，混勻后避光孵育30 min，用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.9 基因表達(dá)

血細(xì)胞總RNA的提取參照Trizol (Invitrogen)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，cDNA的合成按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。引物序列均來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Premier Primer 5.0設(shè)計(jì)引物。引物序列如表1所示。熒光定量PCR使用TaKaRa公司的SYBR Premix EX Taq試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作。熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，設(shè)計(jì)用滅菌超純水代替cDNA模板的陰性對(duì)照，每個(gè)樣品至少設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增結(jié)束后啟動(dòng)熔解曲線收集程序，根據(jù)熔解曲線的溫度判斷擴(kuò)增過(guò)程的特異性并對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析。所得數(shù)據(jù)以ABI 7500 SDS進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量(Guoetal.，2015)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Pearson分析ROS和NO含量與血細(xì)胞凋亡率之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞凋亡率

在脅迫后的3 h，Cu2+對(duì)血細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著影響，在脅迫后的6～48 h，血細(xì)胞凋亡顯著升高，在48 h時(shí)達(dá)到39.01%，是對(duì)照組的5.38倍(圖1)。

圖1 Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞凋亡率的影響

*P<0.05，下同the same below.

2.2 ROS含量

ROS含量的變化趨勢(shì)和血細(xì)胞凋亡率較為一致(圖2)，在脅迫后的3 h，ROS含量無(wú)顯著變化(P>0.05)，在脅迫后的6～48 h，ROS的含量顯著升高(P<0.05)，在48 h由對(duì)照組的86.32上升到106.31。

圖2 Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞ROS含量的影響

2.3 NO含量

Cu2+對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞中NO含量的影響如圖3所示，在脅迫的3 h，NO含量變化不顯著(P>0.05)，在脅迫后的6～48 h，NO含量持續(xù)增加，并與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，最高值出現(xiàn)在48 h，為126.08。

圖3 Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞一氧化氮含量的影響

2.4 酯酶活性

酯酶活性在脅迫后的3～48 h都呈顯著下降的趨勢(shì)(P<0.05)，最低值出現(xiàn)在48 h，由對(duì)照組的117.78下降到88.40(圖4)。

圖4 Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦血細(xì)胞酯酶活性的影響

2.5 ROS含量與血細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

在脅迫48 h后，ROS含量與血細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.83(圖5)。

圖5 ROS含量和血細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性(n=36)

2.6 NO含量與血細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

在脅迫48 h后，NO含量與血細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(P<0.001)，Pearson相關(guān)性系數(shù)為0.93(圖6)。

圖6 NO含量和血細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性(n=36)

2.7caspase-3相對(duì)基因表達(dá)量

在脅迫后的3 h，Cu2+對(duì)羅氏沼蝦caspase-3的相對(duì)基因表達(dá)量無(wú)影響，在脅迫后的6～48 h，caspase-3的相對(duì)基因表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，并在24 h達(dá)到最高值，由對(duì)照組的1.01增加到1.56(圖7)。

圖7 Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦caspase-3相對(duì)基因表達(dá)量的影響

2.8α-2M相對(duì)基因表達(dá)量

在脅迫后的0～6 h，Cu2+對(duì)羅氏沼蝦α-2M基因表達(dá)量無(wú)影響，在脅迫后的12 h，α-2M基因的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)并達(dá)到峰值，24 h時(shí)有短暫的降低，但與對(duì)照組相比仍有顯著增加的趨勢(shì)(P<0.05)，在48 h，α-2M基因的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)(圖8)。

圖8 Cu2+脅迫對(duì)羅氏沼蝦α-2M相對(duì)基因表達(dá)量的影響

3 討論

血細(xì)胞在甲殼動(dòng)物的免疫功能中起著舉足輕重的作用(Havanapanetal.，2016)，血細(xì)胞參數(shù)和血細(xì)胞凋亡率是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫、生理狀態(tài)和細(xì)胞過(guò)程的重要指標(biāo)(Xianetal.，2010；Silva-Aciareetal.，2013)，血細(xì)胞的損傷會(huì)降低免疫功能，甚至?xí){蝦類(lèi)的生存(Lorenzonetal.，1999；Xianetal.，2010)。據(jù)報(bào)道，受溫度(Changetal.，2009)、亞硝酸鹽(Guoetal.，2013)和脂多糖(Xianetal.，2013)等非生物因素刺激時(shí)，凡納濱對(duì)蝦Litopenaeusvannamei和斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon的血細(xì)胞凋亡率均顯著增加。本文的研究也發(fā)現(xiàn)，在受到Cu2+脅迫時(shí)，羅氏沼蝦的血細(xì)胞凋亡率也顯著增加，說(shuō)明當(dāng)蝦類(lèi)受到各種環(huán)境因子脅迫時(shí)，可誘導(dǎo)血細(xì)胞發(fā)生凋亡。

ROS是一類(lèi)高活性的化學(xué)物質(zhì)，參與了細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖和分化，并在先天性免疫防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用(Yangetal.，2013)，正常情況下ROS的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激或病菌感染時(shí)，細(xì)胞會(huì)行使功能吞噬外來(lái)物，在行使吞噬功能的過(guò)程中，細(xì)胞還會(huì)產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)(如ROS)抑制或殺死外來(lái)物。而持續(xù)不斷的刺激會(huì)使ROS含量迅速上升，打破了機(jī)體內(nèi)ROS含量的平衡，過(guò)高的ROS含量對(duì)細(xì)胞自身造成傷害，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(Gill & Tuteja，2010)。NO 是一種廣泛存在于各組織器官中的重要信使分子，能維持體內(nèi)微循環(huán)內(nèi)環(huán)境恒定和保護(hù)機(jī)體非特異性免疫功能(汪義軍，1997)。研究表明，ROS 和NO具有協(xié)同作用，共同調(diào)控應(yīng)答脅迫反應(yīng)的基因表達(dá)(Scheleretal.，2013)。NO和ROS都具有雙重的生理效應(yīng)，低濃度的NO和ROS可以抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體是有益的，而高濃度的ROS和NO會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的傷害，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生(Simonetal.，2000；Brown，2010)。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ROS、NO和血細(xì)胞凋亡率的Pearson相關(guān)性系數(shù)分別為0.83和0.93，進(jìn)一步驗(yàn)證了ROS和NO會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

酯酶是一種廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)的水解酶，與外源性物質(zhì)的消除和降解有關(guān)，雖然并不直接參與重金屬的解毒，但酯酶系統(tǒng)的狀態(tài)反映了機(jī)體抵抗外界不良環(huán)境的能力(Zverevaetal.，2003)。因此，酯酶是毒理學(xué)領(lǐng)域具有重要意義的一種酶(Rashidetal.，2013)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，被用作檢測(cè)藥物殘留的“指示器”(Begumetal.，2008)，也用于檢測(cè)細(xì)胞活性。當(dāng)細(xì)胞的酯酶活性下降時(shí)，被認(rèn)為是細(xì)胞活性下降，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(郭慧等，2015)。研究表明，斑節(jié)對(duì)蝦在受到Cd2+刺激時(shí)，血細(xì)胞中的酯酶活性顯著降低(Xianetal.，2014)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在受到Cu2+脅迫時(shí)，羅氏沼蝦血細(xì)胞的酯酶活性也被顯著抑制。在脅迫3 h后，酯酶的活力開(kāi)始顯著降低，至48 h時(shí)，由對(duì)照組的117.78顯著下降到88.40。酯酶活性的降低與ROS、NO和細(xì)胞凋亡率的升高大體一致。郭慧等(2015)對(duì)亞硝酸鹽脅迫下凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，酯酶活性在24 h才開(kāi)始顯著降低，這可能與脅迫因子和實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同有關(guān)。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮主導(dǎo)功能，因此，細(xì)胞或組織中Caspase-3的活性是檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的重要方法(Zverevaetal.，2003)。對(duì)caspase-3進(jìn)行RNA干擾以后，對(duì)蝦的死亡率顯著降低(Rijiravanichetal.，2008)，說(shuō)明caspase-3在細(xì)胞凋亡中有著舉足輕重的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫的12 h、24 h和48 h，caspase-3的表達(dá)量均顯著升高，24 h達(dá)到峰值后在48 h略降低，caspase-3的這種表達(dá)模式與低溫脅迫下凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)模式類(lèi)似，即都在表達(dá)高峰后出現(xiàn)輕微降低，但與對(duì)照組相比仍有顯著差異(Changetal.，2009)。caspase-3表達(dá)量的顯著升高在12 h出現(xiàn)，而ROS和NO的顯著升高是在6 h，推測(cè)是ROS和NO的升高誘導(dǎo)了caspase-3的表達(dá)。

α-2M是一種在無(wú)脊椎動(dòng)物中參與宿主防御機(jī)制的非特異性蛋白酶抑制劑(Shanthi & Vaseeharan，2014)，在抑制和清除有害蛋白酶的過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Gonias，1992)。據(jù)報(bào)道，羅氏沼蝦、保羅美對(duì)蝦Farfantepenaeuspaulensis和印度明對(duì)蝦Fenneropenaeusindicus在注射細(xì)菌、真菌和病毒后，血細(xì)胞中α-2M的表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)，認(rèn)為α-2M與蝦類(lèi)的先天免疫有關(guān)(Hoetal.，2009；Perazzoloetal.，2011；Shanthi & Vaseeharan，2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cu2+脅迫下，α-2M的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，推測(cè)甲殼動(dòng)物的α-2M表達(dá)模式不僅可以被微生物和病毒調(diào)控，還會(huì)受到重金屬脅迫的影響。α-2M的表達(dá)量在12 h和24 h時(shí)顯著上升，并在24 h達(dá)到峰值，在48 h又顯著下降，推測(cè)在Cu2+脅迫早期，血細(xì)胞中的α-2M被激活參與到機(jī)體的免疫反應(yīng)中，在脅迫48 h時(shí)，血細(xì)胞中的NO和ROS含量以及血細(xì)胞的凋亡比例都達(dá)到最高值，此時(shí)機(jī)體的免疫功能顯著降低，因此α-2M的表達(dá)量也受到顯著抑制。

綜上所述，在Cu2+脅迫下，機(jī)體的酯酶活性受到顯著抑制，免疫功能受到影響，機(jī)體通過(guò)誘導(dǎo)NO和ROS的產(chǎn)生以及免疫相關(guān)基因α-2M的表達(dá)來(lái)對(duì)抗Cu2+脅迫帶來(lái)的損傷。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)高濃度的NO和ROS對(duì)機(jī)體自身造成了氧化損傷，誘導(dǎo)了凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說(shuō)明Cu2+對(duì)蝦類(lèi)具有免疫抑制性和毒性。相關(guān)性分析表明，NO和ROS的升高可能是細(xì)胞凋亡的主要誘因。

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Effects of Cu2+Stress on Hemocytes Toxicity andcaspase-3,α-2MGene Expression inMacrobrachiumrosenbergii

GUO Hui, ZHU Xiaowen, OU Ronghua, LU Zhicheng, TAN Cuiting, SHEN Yuchun, ZHU Chunhua*

(Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang, College of Fisheries,Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong Province 524025, China)

The present study analyzed the toxic effects of Cu2+on apoptotic cell ratio, ROS production, esterase activities, NO production, and the expression levels ofcaspase-3 andα-2Min hemocytes ofMacrobrachiumrosenbergii. The results showed that the changes of apoptotic cell ratio were consistent with ROS production which was increased significantly (P<0.05) after exposure for 6～48 h. Esterase activities were significantly decreased (P<0.05) at 3～48 h and the minimum was observed at 48 h. The NO production continued increasing and the level became significant difference (P<0.05) after exposure for 6～48 h. The relative expression levels ofcaspase-3 were significantly induced (P<0.05) after exposure for 6～48 h, and reached the peak at 24 h. The relative expression ofα-2Mwas significantly increased (P<0.05) and reached the peak at 12 h. Moreover, the expression level ofα-2Mreduced after exposure for 24 h and became significantly different(P<0.05) at 48 h. Correlation analysis showed that significant positive correlation (P<0.001) between apoptotic cell ratio and ROS production was observed, as well as apoptotic cell ratio and NO production. All these results suggested that esterase activities were significantly inhibited after Cu2+exposure, while NO and ROS production as well asα-2Mexpression were induced against Cu2+exposure. Along with stress time increasing, overfull production of ROS and NO caused oxidative stress to prawn and then induced the expression level ofcaspase-3 which finally resulted in apoptosis, indicating that Cu2+stress may have immunosuppressive and toxic effects toM.rosenbergii, and the increased production of NO and ROS might be the main cause of apoptosis.

Macrobrachiumrosenbergii； Cu2+； hemocytes toxicity； gene expression； apoptosis

2017-02-08 接受日期：2017-03-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31600321)； 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030310438)； 廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校工程科研項(xiàng)目(GDOU2016050253)； 廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師特別資助計(jì)劃項(xiàng)目(HDYQ2015003)

郭慧(1986—)， 女， 講師， 博士， 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究， E-mail：guohuivivian@163.com

*通信作者Corresponding author， 男， 教授， 主要從事水域生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境研究， E-mail：zhu860025@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20170035

X503.225； Q959.223

A

1000-7083(2017)03-0293-07