鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌作用研究

林 玲，黃杰榮，魯 靜，張魯榕，林金科，*

（1.福建農林大學園藝學院，福建福州350002；2.福建農林大學安溪茶學院，福建泉州362000；3.福建省臨床醫學實驗平臺；4.福建省個體化主動免疫治療重點實驗室；5.福建省放射生物福建省高校重點實驗室，福建福州350005）

鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌作用研究

林 玲1，黃杰榮1，魯 靜2，張魯榕3，4，5，林金科1，2*

（1.福建農林大學園藝學院，福建福州350002；2.福建農林大學安溪茶學院，福建泉州362000；3.福建省臨床醫學實驗平臺；4.福建省個體化主動免疫治療重點實驗室；5.福建省放射生物福建省高校重點實驗室，福建福州350005）

本文研究鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌MDA-MB-468細胞的作用。以鐵觀音按照1:25的茶水比進行浸提30min的茶湯為原始濃度的試驗樣品，利用MTT法測定人乳腺癌細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測細胞凋亡比例并進行凋亡相關蛋白的檢測。結果表明：鐵觀音黃片和茶末均能抑制乳腺癌MDA-MB-468細胞的增殖，其干預MDA-MB-468細胞48h的IC50分別為終濃度稀釋119.87±12.22倍和117.56±21.73倍。用其IC50濃度進行誘導細胞凋亡試驗，表明了該兩種品類鐵觀音副產品均能顯著提高MDA-MB-468細胞的凋亡比例，且這兩種鐵觀音副產品均是通過促進Caspase 9和Caspase 3蛋白的活化來誘導細胞凋亡的。

鐵觀音；乳腺癌；細胞凋亡；作用機制

乳腺癌是當今世界癌癥死亡率較高的疾病，是女性最常見的惡性腫瘤，其發病率已位居女性惡性腫瘤的首位[1]。目前其治療手段主要以外科手術為主的綜合治療，并輔以化療藥物。但由于化療藥物的毒副作用、耐藥性等因素，嚴重影響化療的療效，并在一定程度上降低了患者生存質量[2]。近年來，對茶葉保健功效的研究如火如荼，其抗癌作用也是研究的熱點之一。茶葉中的EGCG、茶多酚和茶氨酸等多種成分都被報道具有良好的抗癌作用[3-7]。但以茶湯作為研究對象的報道確極少見。鐵觀音茶是中國的十大名茶之一[8-11]，其在福建茶產業中占有重要地位，但其在抗乳腺癌的作用方面尚未明確。所以本文選取了鐵觀音產業鏈中兩種副產品，黃片和茶末，探索其對乳腺癌MDAMB-468細胞的作用，為鐵觀音副產品綜合利用、拓寬茶葉在抗癌方面的功效研究提供參考價值。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

鐵觀音黃片和茶末由安溪縣桃源有機茶場有限公司提供。

MDA-MB-468細胞株購于中國科學院上海細胞所。

試劑：胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養基、青鏈霉素溶液、胰蛋白酶、（美國Hyclone公司），RIPA裂解液、Marker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），兔抗人β-actin蛋白多克隆抗體、兔抗人Caspase 3蛋白多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），鼠抗人Caspase 9蛋白多克隆抗體（英國Rab MAb公司），MTT（北京索萊寶科技有限公司）。

儀器：倒置相差顯微鏡（日本Olympus），臺式冷凍離心機（美國Beckman），CO2培養箱（美國Thermo），化學發光成像系統（美國Protein Simple），酶標儀（美國Thermo），生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），-70℃低溫冰箱（日本SANYO）。

1.2 方法

鐵觀音黃片和茶末按1:25的茶葉重量與水體積比，用沸水在98℃的水浴鍋中浸提30min，濾紙過濾、冷卻后，用0.22um的過濾器進行過濾除菌、分裝，-20℃保存，即為相應的鐵觀音黃片和茶末原濃度試驗樣品。

細胞培養：人乳腺癌MDA-MB-468細胞使用含10%胎牛血清、青霉素與鏈霉素各l00U/ml的DMEM高糖培養液培養，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞生長至70%～80%后，用0.25%的胰酶消化傳代[12]。

MTT法檢測細胞增殖：取生長狀態良好的對數生長期MDA-MB-468細胞，制成細胞懸液，調整細胞濃度為2×104個/ml，利用排槍每孔接種150ul于96孔板中。置于37℃，5%CO2的培養箱中培養，待細胞貼壁后加入50ul用完全培養液稀釋的茶湯試驗樣品。置于培養箱培養48h后，小心棄去原培養液，每孔加入含有10%MTT（5mg/ml）的完全培養液200ul恒溫培養箱染色4h后，小心吸取上清液，每孔加入150ul DMSO，充分振蕩10min后，用酶標儀在490nm處測定各孔的吸光度（OD值），計算細胞增殖抑制率[13]。

事先對待試驗茶湯用完全培養液進行稀釋，使得干預終濃度為原試驗茶湯濃度的10，50，100，150，200，250，300倍。各組實驗設置3個平行孔，實驗重復3次。

按照細胞增殖抑制率（%）=(1—實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%，計算各組實驗的細胞增殖抑制率，并通過SPSS計算出各組實驗IC50所對應的相應終濃度稀釋倍數，進行后續實驗。

2.3.2 使用時效。在水產養殖之前，需要定期投放微生物制劑，盡可能將環境污染因子所造成的影響降至最低。同時使用越早，成效越顯著。在水產養殖后期，水體質量相對較差，影響微生物的生長，若在此時才開始運用，在短期內難以實現預期目標。根據相關資料可知，需要定期應用微生物制劑以保持平穩的水色與菌藻均衡，在養殖初期需要每周使用1次，后期為了提升水體的透明度，需要每周使用2次，持續使用兩三次。

流式細胞術檢測細胞凋亡：取生長狀態良好的對數生長期MDA-MB-468細胞，制成懸液，調整細胞密度為4.5×105個/ml，在6孔板中每孔加入1ml的細胞懸液。置于培養箱中培養，待細胞貼壁后按照各組MTT中計算的IC50濃度，加入各試驗組預先用完全培養液稀釋后的茶湯25ul，置于培養箱中培養48h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，采用Annexin V-FITC法，根據細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作，用流式細胞儀進行上機檢測[14]。實驗重復3次。

Western blotting檢測凋亡相關蛋白試驗：提取細胞總蛋白：收集各組茶湯IC50濃度下干預48h的各組細胞，蛋白裂解液于冰上裂解細胞30min后，于4℃，12000rpm離心機上離心5min，取上清液，用BCA法測定總蛋白濃度，并用裂解液稀釋成相同濃度，加入蛋白上樣緩沖液，充分混勻，沸水浴5min后-20℃保存，待測[15-17]。

取待測蛋白，進行電泳1.5h，轉膜1h，將蛋白轉至PVDF膜上，TBST洗膜2次，5%脫脂奶粉封閉1h，TBST洗膜3次，一抗孵育1h或者4℃冰箱過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1h，TBST洗膜3次，加入發光液進行顯影[15]。

圖像分析，使用Image-J軟件和Excel軟件進行光密度值分析。蛋白相對表達量=蛋白條帶密度/相應β-actin條帶密度。

1.3 統計分析

實驗結果數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，實驗數據均采用平均值加減標準差（±s）來表示。

2 結果與分析

鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細胞增殖抑制率的影響均有其稀釋倍數呈負相關關系，即與茶葉干預濃度呈正相關關系。茶葉濃度越高，對細胞的增殖抑制越明顯。詳見表1。通過SPSS計算茶葉干預MDA-MB-468細胞48h時，其IC50對應的茶湯稀釋濃度分別為：黃片組119.87±12.22倍，茶末組117.56±21.73。鐵觀音黃片和茶末的IC50濃度沒有明顯差距，說明了2種鐵觀音副產品對乳腺癌細胞MDA-MB-468的干預效果相當。

2.2 鐵觀音黃片和茶末對乳腺癌細胞凋亡的影響

正常組MDA-MB-468細胞凋亡比例為3.18±0.41%，與正常組對比，黃片組和茶末組的細胞凋亡比例均顯著增加（P<0.05），分別為18.55±2.08%和19.73±3.09。詳見表2，圖1。可見鐵觀音黃片和茶末誘導乳腺癌細胞MDAMB-468凋亡的效果相當。

2.3 鐵觀音黃片和茶末對細胞凋亡相關蛋白表達的影響

從圖2和圖3可以看出，鐵觀音黃片和茶末均能顯著提高乳腺癌細胞MDA-MB-468凋亡相關蛋白Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9的表達水平（P<0.05）。在Cleaved-caspase3蛋白表達水平上，黃片組和茶末組的相對表達水平都提高了2倍以上的。在Cleaved-caspase 9蛋白表達水平上，黃片組提高了84%，茶末組提高了143%。但對Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9兩個蛋白表達水平的促進上，茶末組均比黃片組作用更強。

表1 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細胞增殖抑制率的影響（%）

表2 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細胞凋亡的影響（48h，±s）

表2 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細胞凋亡的影響（48h，±s）

??? ??? ??? ???%? 3.18–0.41 18.55–2.08* 19.73–3.09*

圖1 不同鐵觀音茶對MDA-MB-468細胞凋亡的影響

圖2 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

圖3 鐵觀音黃片和茶末對MDA-MB-468細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

3 討論

在本研究中，鐵觀音黃片和茶末均能有效抑制乳腺癌細胞MDA-MB-468的增殖，且均通過誘導細胞凋亡，影響乳腺癌細胞的正常增殖。該結果與前人研究茶葉或茶葉單體的抗癌作用結果一致。尚澤森，馬麗清等[18]研究表明可通過利用EGCG抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的周期進程，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。易香華[19]研究普洱茶抑制乳腺癌SHZ-88細胞及保護亞基肌誘導的胃癌前病變和放療損傷的作用，其MTT結果顯示普洱茶呈時間和劑量依賴性顯著抑制SHZ-88細胞的增殖，流式細胞術結果表明普洱茶能顯著促進SHZ-88細胞的凋亡和壞死。綜上都表明了茶葉能夠誘導乳腺癌細胞凋亡，有效抑制乳腺癌細胞的增殖作用。

Caspase家族在細胞凋亡的啟動和執行階段發揮著重要作用，其可分為凋亡起始者（如caspases2,8,9,10）和凋亡執行者（caspases3,6,7）[20-22]。Caspase 9是內源凋亡通路的凋亡啟動起始者，激活Caspase 9進而觸發Caspase級聯反應，活化的Caspase 9即Cleaved-caspase 9對下游的凋亡執行者Caspase 3進行活化和切割，活化的Caspase 3即Cleaved-caspase 3以細胞內的重要蛋白作為靶點，進行水解裂解，導致了細胞程序性死亡。本研究中，鐵觀音黃片和茶末均能促進提高細胞Caspase 9的活化水平，進而發生Caspase級聯反應，刺激信號通路下游Caspase 3的活化，最終促使乳腺癌MDA-MB-468細胞的凋亡。該結果與前人研究茶葉單體對Caspase 3和Caspase 9的作用結果一致。王旭，強兆艷等[23]研究塞來昔布與茶多酚合用對乳腺癌細胞細胞增殖及凋亡的影響，結果表明塞來昔布和茶多酚單用及合用均能上調Bax、Cleavedcaspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白的表達，兩藥合用具有協同作用。徐澤平[24]探討茶多酚誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的作用機理，結果表明隨著茶多酚濃度的提高，Caspase 3活力逐漸升高，具有時間—劑量依賴性，說明茶多酚可以誘導MCF-7細胞Caspase 3活化。

通過對鐵觀音黃片和茶末體外抗人乳腺癌細胞的效果和機理的研究，為茶葉在保健功效中的療效提供了理論依據，同時為更好地研究茶葉在體內的作用功效提供了研究方向和參考價值。

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安溪縣人民政府科技資助項目（KH1500790，K1515059A）；福建農林大學科技發展資金（KF2015122）。

林 玲（1990-），女，碩士研究生，主要從事茶葉保健功能研究。

*通訊作者：林金科（1967-），男，教授，主要從事茶深加工與保健、茶資源育種與生物技術方面研究。E-mail：ljk213@163.com。