瓜氨酸對盲腸結扎穿孔膿毒癥大鼠心臟的保護作用機制研究

羅玉龍　周吉秋　武楠　黃偉　張森

【中圖分類號】R364.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）05-0-01

膿毒癥伴發心肌損傷造成心臟功能障礙是膿毒癥患者常見的死亡原因之一，預防和控制膿毒癥患者心肌損傷可有效降低膿毒癥患者的死亡率。目前認為膿毒癥造成心臟損傷的主要原因包括炎癥細胞因子的浸潤，氧化應激損傷等。瓜氨酸，一種不存在于蛋白質中的L-a-氨基酸能促進精氨酸進入內皮細胞和免疫細胞，在一定程度上提升精氨酸的作用，可通過負反饋調節NO的生成，同時瓜氨酸還具擴張血管、降血壓、抑制血管內皮細胞增殖等作用。本研究擬通過盲腸結扎穿孔模型，通過補充瓜氨酸，探討其對膿毒癥大鼠心臟的組織病理變化、心肌酶水平和抗氧化能力的變化，為膿毒癥心肌損傷的預防及治療提供新思路。

1.材料和方法

1.1 主要材料和儀器 瓜氨酸（合肥博美生物科技有限責任公司），蛋白定量測試盒、總超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）測試盒（南京建成生物研究所），生化自動分析儀。

1.2 實驗動物和分組 無特定病原體級健康雄性Wistar大鼠，體重250～300g，7～10周齡。大鼠按隨機數表法分六組：正常空白對照組（Normal）、假手術組（sham）、膿毒癥組（CLP）、瓜氨酸治療組（CLP+Cit），各組8只大鼠。

1.3 動物模型制備 Wister大鼠稱重、編號。Normal組不做特殊處理；sham組麻醉開腹，略微翻動盲腸后縫合關腹；CLP組行CLP術，麻醉后沿腹中線做一條長約2cm切口，于盲腸中段部位4.0絲線結扎打結，21號無菌針頭貫穿腸管，擠壓盲腸末端讓糞便內容擴散到腹膜后關腹；CLP+Cit組術前瓜氨酸灌胃給藥7d，劑量為200mg/kg·d-1，余操作同膿毒癥組。

1.4 標本采集與處理 各大鼠于術后6h、12h麻醉后經腹主動脈取血5ml，待血清析出后3000r/min離心15min，取上清-80℃保存備測。取血后處死大鼠，摘除大鼠心臟放入4℃生理鹽水中漂洗，去除包膜及血管，取各組大鼠少量心肌組織以10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察心肌組織病理變化，余下心臟標本-80℃保存備測。

1.5 大鼠血生化檢測 取大鼠1ml血清，全自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、乳酸脫氫酶LDH、a-羥丁酸脫氫酶的水平HBDH；南京建成生物工程研究所的NO測定試劑盒和NOS分型測定試劑盒測定各組大鼠血清NO含量及iNOS活力；

1.6 大鼠心臟組織SOD、MDA的測定 取大鼠心臟組織100mg，制備成10%的組織勻漿，取上清得到組織勻漿液，考馬斯亮藍法進行蛋白定量測定，采用南京建成生物工程研究所的SOD、MDA試劑盒測定心臟組織勻漿液中SOD、MDA水平。

1.7 統計學方法 采用spss17.0軟件包對研究數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均值±標準差（±s）的形式進行描述，計量資料組間比較采用單因素方差分析進行，所有檢驗以雙側Ρ<0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 大鼠心臟組織病理學（HE×400）

光鏡下，HE染色可見Normal組大鼠心肌橫紋肌纖維（×400倍）結構清晰，肌纖維核呈卵圓形，位于細胞中央；CLP組大鼠心肌纖維間被炎性細胞浸潤，心肌細胞變細，心肌間質水腫；CLP+Cit組大鼠心肌纖維間炎性細胞浸潤較CLP組輕，心肌細胞大小變化不大，心肌間有滲出現象。

2.2 大鼠心肌酶檢測

在術后6h，12h兩個時間點，CLP組大鼠血清CK、HBDH及NO顯著高于CLP+Cit組（P<0.05），而CLP組與CLP+Cit組血清LDH、iNOS差別不大（P>0.05）。

2.3 大鼠心臟組織SOD、MDA的測定

在實行CLP造模術后，CLP+Cit12h亞組大鼠心臟組織中SOD的活力值均高于CLP組相對應的亞組（P<0.05）；而CLP12h亞組大鼠心臟組織中MDA的水平均高于CLP+Cit相對應的亞組（P<0.05）。

3.討論

膿毒癥初期，機體啟動快速防御機制清除病原體，外周血中性粒細胞數目增多，吞噬性增強，血小板的數目增多，粘附與聚集性加強。另外，膿毒癥所產生釋放的炎癥因子對組織臟器細胞可通過直接造成臟器損傷。最后，在內毒素及炎癥細胞因子的作用下，iNOS的活力增加，誘導生成更多的NO，加重炎癥反應。我們在前期研究中發現補充瓜氨酸能緩解早期膿毒癥促炎細胞因子的釋放，并增加機體后期抗炎細胞因子的釋放，緩解膿毒癥大鼠炎癥反應。

研究結果顯示，補充外源性瓜氨酸后，病理損害減輕，血清NO濃度下降，CLP+Cit組的血清CK、LDH、HBDB也均低于CLP組，提示瓜氨酸可降低血清中CK、CK-MB、LDH、HBDH、NO水平，提高心臟抗氧化能力，減輕膿毒癥對心臟組織的損害。其作用機制可能與瓜氨酸作為精氨酸的合成前體，一方面促進了精氨酸的合成，提升了精氨酸的作用，造成NO的生成增多，導致炎癥細胞因子的生成減少，改善了大鼠的缺血缺氧的病態；另一方面瓜氨酸可通過“Cit-NO”循環，拮抗NO大量生成，避免了NO蓄積所造成負反應對大鼠的損害；但具體的作用機制還有待繼續深入的研究。

參考文獻

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