百里醌對兔骨關節炎模型關節軟骨的保護作用及機制

鐘甫華 江彬鋒 曾宇晴 黃愷 陸建偉

●論 著

百里醌對兔骨關節炎模型關節軟骨的保護作用及機制

鐘甫華 江彬鋒 曾宇晴 黃愷 陸建偉

目的 探索關節腔內注射百里醌對兔骨關節炎模型關節軟骨的保護作用及機制。方法 選用新西蘭大白兔構建動物模型，分為百里醌組、骨關節炎組和假手術組各20只，觀察并記錄實驗大白兔6min內步行距離。術后9周處死動物取左膝關節標本進行大體組織學Gross評分，切片行蘇木精-伊紅（HE）染色、番紅染色后進行組織病理學Mankin評分，采用RT-PCR檢測3組大白兔關節軟骨中基底金屬蛋白酶-13（MMP-13）、基底金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）和2型膠原（CollagenⅡ）等靶基因表達水平。 結果 百里醌組大白兔的行走距離明顯大于骨關節炎組（P＜0.05）；而Gross評分、Mankin評分均低于骨關節炎組（均P＜0.05）。與骨關節炎組比較，百里醌組MMP-13mRNA表達水平明顯下降（P＜0.05），TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達水平明顯上升（均P＜0.05）。 結論 百里醌對兔骨關節炎模型的關節軟骨具有保護作用，可以減少疼痛，延緩骨關節炎的進展。百里醌可能通過下調MMP-13mRNA表達，上調TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達的分子機制實現保護作用。

百里醌 骨關節炎 動物模型

骨關節炎是一種多見于中老年人的退行性疾病，它是機械性因素和生物性因素相互作用的結果。該病主要表現為軟骨細胞與基質形態學、生物化學、分子生物學和生物力學的改變，導致關節軟骨軟化和纖維化、軟骨下骨硬化，形成骨贅和軟骨下骨囊腫[1]。骨關節炎的典型臨床特征是關節疼痛、運動受限、捻發音、關節滲液和關節炎癥。目前主要應用非甾體抗炎藥、關節腔內注射類固醇激素或透明質酸鈉等藥物治療[2]，但這些藥物只能起到緩解癥狀的作用，并不能從根本上延緩關節軟骨的漸進性退變。因此，尋找能阻斷骨關節炎自然病程的藥物已成為研究的熱點[3]。近年來的研究表明骨關節炎的主要病理學特征是關節軟骨細胞外基質的降解，其中細胞外基質的主要成分[聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、2型膠原（CollagenⅡ）]漸進性丟失是骨關節炎早期伴軟骨退變的一種最主要的病理學變化[4-8]。百里醌是一種從中東國家的黑種草籽油中分離出來的主要有效單體，除了具有強大的抑瘤作用（抑制乳腺癌[9]、胰腺癌[10]和前列腺癌[11]等腫瘤細胞的生長）外，還能抑制人臍靜脈內皮細胞介導的血管生長[12]。有文獻報道百里醌能調控機體中與骨關節炎發病有關的信號通路，有望成為治療骨關節炎的有效藥物[13]。故本研究選擇新西蘭大白兔建立骨關節炎動物模型，使用百里醌進行治療，以觀察對關節軟骨的保護作用并探討相關機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 百里醌10g（CAS 490-91-5，上海阿拉丁公司）溶于磷酸鹽緩沖液（500g，17 202，美國Sigma公司）中，制備成100μmol/L的百里醌溶液；番紅染色劑（25g，39 955，美國Sigma公司）；Trizol試劑（100ml，T9424,美國Sigma公司）；逆轉錄試劑盒（000000010109118001，美國Sigma公司）；PCR試劑（XNAB2-1KT，美國Sigma公司）；熒光定量PCR儀器（QuantStudio 7，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 實驗動物 雄性新西蘭大白兔60只，體重2.5～ 3.0kg，由浙江大學實驗動物中心提供。開始實驗前，所有大白兔先在動物房適應1周。隨機分為3組，每組20只。（1）百里醌組：所有大白兔用25%氨基甲酸乙酯（4ml/kg，上海瑞生物技術公司）作靜脈麻醉，經膝關節內側切口進入關節腔，直視下切斷前交叉韌帶，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后逐層縫合關節腔；分籠飼養；術后3d，每天予肌肉注射青霉素40萬U；膝關節（踝關節以上3cm、腹股溝以下1.5cm處）彎曲30°～40°，用石膏綁帶制動4周；足背動脈可及。成功構建模型后每3d檢測松緊度并適當調整；分籠飼養，禁止隨機移動。術后4周開始在膝關節腔內注射預先配置好的百里醌溶液0.1ml，每周連續注射5d，共5周。（2）骨關節炎組：相同方法建模、固定及飼養。術后4周開始在膝關節腔內注射磷酸鹽緩沖液0.1ml，每周連續注射5d，共5周。（3）假手術組：采用相同的手術入路暴露關節腔，顯露前交叉韌帶后不切斷，逐層縫合切口；術后固定、飼養方法同上。關節腔內不注射任何藥物。

1.3 方法

1.3.1 疼痛相關行為學評估 將實驗大白兔放進測試屋適應30min后，再放進一個有機玻璃方形空間內自由行走，并對其進行視頻錄像。骨關節炎的疼痛相關行為學評估結果用大白兔6min內步行距離表示。

1.3.2 大體組織學評分 術后9周所有大白兔在25%氨基甲酸乙酯靜脈麻醉下，耳緣靜脈注射20ml空氣處死。行大腿內側切口，在膝關節上方0.5cm處分離股四頭肌。取膝關節標本，包含股骨髁。依照實驗盲法的原則，由高年資的病理科和骨科各1位醫師在手術顯微鏡下觀察股骨髁軟骨表面退變情況，按照Gross評分標準進行組織學評分：關節面完整，色澤如常為0分；關節面粗糙，有小裂隙且色澤灰暗為1分；關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表層或中層為2分；關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層為3分；軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露為4分。

1.3.3 組織學檢查 取股骨內髁關節面軟骨，在預冷的磷酸鹽緩沖液中沖洗干凈；在甲醛溶液中固定24h，使用快速脫鈣液（RLG3801，中國上海容創生物技術有限公司）脫鈣2d；石蠟包埋，5μm厚切片；分別作HE染色、番紅染色。依據盲法原則，由高年資病理科和骨科各1位醫師根據Mankin評分標準對軟骨切片進行定量評分；若兩者評分結果不一致，則共同討論并達成共識。

1.3.4 RT-PCR檢測靶基因mRNA表達水平 取股骨內髁關節面軟骨組織10mg置于1m l Trizol中勻漿并提取總的RNA。取2μg RNA逆轉錄成互補脫氧核糖核酸（cDNA），逆轉錄的反應體系按照逆轉錄試劑盒說明書進行。每個樣本重復3次，以18S核糖體RNA為內參。使用試劑盒行PCR擴增反應（5ng cDNA，45個循環：95℃10s，60℃25s）。基質金屬蛋白酶13（MMP-13）、基底蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、Aggrecan、CollagenⅡ、18S引物設計和合成均由上海英駿生物技術有限公司完成，具體引物見表1。運用2-△△Ct來分析基因相對表達水平，△△Ct=（Ct靶基因-Ct內參）百里醌治療組-（Ct靶基因-Ct內參）對照組。

表1 各基因引物序列

1.4 統計學處理 應用SPSS15.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 疼痛相關行為學評估結果 百里醌組大白兔的行走距離為（962±22）cm，明顯大于骨關節炎組的（590± 22）cm，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 大體標本觀察結果 假手術組關節軟骨表面光滑平整，未見關節液明顯增多及滑膜明顯增生；百里醌組關節液增多，滑膜增生較明顯，關節周圍韌帶及軟組織無明顯增生、增厚，關節軟骨色澤變暗，軟骨表面小面積糜爛和潰爛，關節周圍偶見小型骨贅可見；骨關節炎組關節液明顯增加且色澤渾濁，關節囊、韌帶及滑膜增生、肥厚，關節軟骨色澤變暗，可見較深的潰瘍，部分可見軟骨下骨質暴露。百里醌組大白兔股骨髁關節軟骨Gross評分低于骨關節炎組（P＜0.05）；但與假手術組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 組織學觀察結果 百里醌組Mankin評分低于骨關節炎組（P＜0.05），見圖3。HE染色：假手術組關節表面光滑完整，關節軟骨層次完整，無炎性細胞浸潤；與假手術組比較，骨關節炎組關節軟骨的層次結構受到破壞，部分被增生組織替代；百里醌組軟骨上層中度組織失衡，但中、下層可見正常的軟骨結構和軟骨組織，見圖4。番紅染色：假手術組軟骨組織分層正常，潮線完整；百里醌組軟骨組織分層無明顯破壞，表層略不平整，潮線基本完整，偶見少量簇聚細胞，染色輕度減退，特別是軟骨表層明顯；骨關節炎組可見表面纖維化，細胞排列紊亂，潮線不規則，簇聚細胞出現頻率增加，染色不均勻褪色，見圖5。

圖1 3組大白兔疼痛相關行為學評估結果（與骨關節炎組比較，*P＜0.05）

圖2 3組大白兔股骨髁關節軟骨Gross評分（與骨關節炎組比較，*P＜0.05）

圖3 3組大白兔股骨髁關節軟骨切片Mankin評分（與骨關節炎組比較，*P＜0.05）

圖4 3組大白兔股骨髁關節軟骨切片HE染色結果（a：假手術組；b：骨關節炎組；C：百里醌組；×100）

圖5 3組大白兔股骨髁關節軟骨切片番紅染色結果（a：假手術組；b：骨關節炎組；c：百里醌組；×100）

2.4 3組關節軟骨靶基因mRNA表達水平比較 與骨關節炎組比較，百里醌組MMP-13mRNA表達水平明顯下降（P＜0.05），TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達水平明顯上升（均P＜0.05），見圖6。

3 討論

兔骨關節炎模型的軟骨損傷、滑膜炎病程進展較大型動物更為迅速[14]，適用于抗骨關節炎藥物的實驗探索。目前有研究推崇的兔骨關節炎模型是膝關節固定制動的，即利用石膏綁帶制動膝關節，在彎曲位置容易誘發關節炎；其機制是關節和肌肉的攣縮、負重表面積的增加以及軟骨生物力學的改變均會導致軟骨退變[15]。Okazaki等[16]發現造模1周后關節軟骨就發生退變；Kojima等[17]發現造模后完全屈曲石膏制動4周，出現了不可逆的軟骨病變。因此，相比于藥物注射、創傷誘發的骨關節炎模型，離斷前叉后膝關節制動方法誘導的軟骨改變更符合膝骨關節的自然病程。本研究在離斷膝前叉韌帶后制動4周引起膝關節軟骨形態和結構改變符合典型的膝骨關節炎病變。由于股骨內髁是膝關節著力的主要部位，該部位的軟骨退變形態最能體現骨關節炎的病變特征；因此，筆者采集股骨內髁關節面軟骨組織標本進行組織學評估。

圖6 3組大白兔關節軟骨MMP-13、TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達水平（與骨關節炎組比較，*P＜0.05）

本研究采取宏觀形態學（Gross評分）與微觀形態學（Mankin評分）相結合的軟骨評分系統來評價百里醌對關節軟骨的保護作用。本研究結果證實百里醌組Gross評分、Mankin評分均低于骨關節炎組；這說明經前交叉韌帶離斷術且4周制動飼養后，大白兔關節軟骨出現了典型的降解破壞形態特征，而百里醌在一定程度上延緩了骨關節炎的進展，對關節軟骨形態具有保護作用。番紅特異性結合基質中蛋白多糖的著色深淺可以反映軟骨蛋白多糖含量，本研究番紅染色結果顯示百里醌組軟骨細胞仍在旺盛地合成基質，提示百里醌組軟骨細胞受到百里醌的保護作用，并且產生更強的細胞外基質合成能力，可以延緩蛋白多糖的丟失。RT-PCR檢測結果顯示與骨關節炎組比較，百里醌組關節軟骨MMP-13mRNA表達水平明顯降低，而TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達水平明顯上升；這與組織病理學結果一致，進一步證實了百里醌對軟骨基質的保護作用。軟骨的細胞外基質主要由CollagenⅡ、Aggrecan組成，而MMP家族是分解軟骨細胞外基質最重要的因子。目前有研究表明百里醌能夠抑制內皮細胞的MMP-2、MMP-9蛋白表達水平從而抑制腫瘤細胞的血管化[18]。而本研究結果提示百里醌對關節軟骨的保護作用可能通過下調MMP-13mRNA表達，上調TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達的分子機制實現的。

目前治療骨關節炎的主要藥物有非甾體消炎鎮痛藥、阿片類藥物、透明酸鈉的替代療法、關節腔內注射糖皮質激素等。以上藥物均有緩解骨關節炎的作用，但無法緩解關節軟骨的退變性病變，多數骨關節炎晚期患者因無法忍受關節疼痛、肢體活動障礙而接受膝關節置換手術。因此，理想的抗骨關節炎藥物不僅能緩解關節代謝過程中的炎性介質，還能改善關節軟骨形態。本研究證實關節腔內注射百里醌對關節軟骨形態具有保護作用，可以減少疼痛，延緩骨關節炎的進展；可能通過下調MMP-13mRNA表達，上調TIMP-1、Aggrecan和CollagenⅡmRNA表達的分子機制實現保護作用，為臨床藥物治療骨關節炎提供了一種新思路。

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Protective effects of thymoquinone on cartilage in rabbit osteoarthritis model

ZHONG Fuhua, JIANG Binfeng, ZENG Yuqing, et al.Departments of Orthopedics, Zhejiang Provincial Tongde Hospital, Hangzhou 310012, China

To evaluate the effects of intra- articular injection of thymoquinone on cartilage in rabbit osteoarthritis model. Methods Sixty New Zealand rabbits were randomly divided into treatment group, model group and control group with 20 in each group. Knee osteoarthritis model was established in thymoquinone and model groups, and sham operation was performed in control group, intraarticular injection of thymoquinone was given to treatment group. The walking distance within 6min was observed and recorded. Rabbits were sacrificed and samples of left knees were collected 9 wks after operation. Gross scores, HE staining, safranin O staining and Mankin score were evaluated. Real- time polymerase chain reactive (PCR) was performed to analysis the mRNA level of MMP- 13, TIMP- 1, aggrecan, collagen Ⅱ in cartilage tissue. Results Compared with model group, the thymoquinone group showed better pain related behavior scores (P＜0.05). Gross score and Mankin score showed that the cartilage lesions of thymoquinone group were less severe than that of model group. The expression of mmp- 13mRNA was lower and the expressions of timp- 1, aggrecan and collagen II mRNA were higher in thymoquinone group than those in model group(P＜0.05). Conclusion Thymoquinone shows protective effects on cartilage, and can delay the disease progress and improve the pain related behavior scores in rabbit osteoarthritis model, which may be associated with down- regulation of mmp- 13 expression and up- regulation of timp- 1, aggrecan, collagenⅡexpression.

Thymoquinone Osteoarthritis Animal model

2016-12-18）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2016-2129

浙江省公益性應用研究計劃項目(2015C37131)

310012杭州，浙江省立同德醫院骨科

陸建偉，E-mail：lkptww01@126.com