γδT細(xì)胞在乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)基因(HBs-Tg)小鼠肝纖維化模型中的作用

孟子愉，吳震州，趙立青

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

γδT細(xì)胞在乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)基因(HBs-Tg)小鼠肝纖維化模型中的作用

孟子愉，吳震州，趙立青

(南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

利用乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)基因(HBs-Tg)小鼠與γδT細(xì)胞缺陷型(TCRδ-/-)小鼠雜交，篩選出HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠.采用腹腔連續(xù)注射四氯化碳(CCl4)的方式建立了小鼠肝纖維化模型，探討了γδT細(xì)胞在HBs-Tg小鼠肝纖維化模型中的作用.結(jié)果表明：與HBs-Tg小鼠相比，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠反映肝損傷和肝纖維化的相關(guān)指標(biāo)ALT及α-SMA，TIMP1，COl1a1基因表達(dá)水平顯著增高——肝纖維化更為嚴(yán)重——γδT細(xì)胞在HBs-Tg小鼠肝纖維化模型中具有保護(hù)作用.為今后γδT細(xì)胞對(duì)肝纖維化的治療奠定了一定基礎(chǔ).

γδT細(xì)胞；肝纖維化；HBs-Tg小鼠

肝臟損傷或慢性炎癥是促進(jìn)肝纖維化形成的關(guān)鍵因素，同時(shí)伴有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，繼而可導(dǎo)致肝硬化或肝功能衰竭.肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝ECM膠原成分的主要來(lái)源，星狀細(xì)胞被持續(xù)激活可產(chǎn)生大量膠原沉積在匯管區(qū)、中央靜脈周圍、肝竇和肝細(xì)胞間促進(jìn)肝纖維化形成.細(xì)胞外基質(zhì)成分包括：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)等[1-2].長(zhǎng)期腹腔注射四氯化碳(CCl4)可構(gòu)建小鼠肝纖維化模型，以用于肝纖維化機(jī)制和治療藥物的研究等.

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染是造成肝纖維化和肝癌的重要原因.HBV的感染可以加速肝纖維化的形成，但是這一過程的免疫應(yīng)答機(jī)制仍不十分清楚，特別是在攜帶乙肝病毒狀態(tài)下.[3]近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)基因(HBs-Tg)小鼠對(duì)于CCl4誘導(dǎo)的肝損傷和肝纖維化高度敏感，并伴有HSC的激活，而這一過程中自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)分泌的白細(xì)胞介素4(IL-4)和白細(xì)胞介素13(IL-13)對(duì)于HSC的激活起到了重要作用.[2]

γδT細(xì)胞作為T細(xì)胞亞群之一，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和功能.與αβT細(xì)胞相比，γδT細(xì)胞的研究相對(duì)滯后.γδT細(xì)胞為主要組織相容性復(fù)合體(MHC)非限制性細(xì)胞，是一種既具有天然免疫應(yīng)答特性，又具備適應(yīng)性免疫應(yīng)答性質(zhì)的淋巴細(xì)胞，所以又稱“固有類淋巴細(xì)胞”(innate-like lymphocytes).根據(jù)T細(xì)胞受體不同，外周γδT細(xì)胞主要分為Vγ1和Vγ4γδT細(xì)胞兩個(gè)亞群，這兩個(gè)亞群在自身免疫性疾病中起很重要的調(diào)控作用.近期的研究表明，胸腺的選擇可能是γδT細(xì)胞分為IFN-γ和IL-17兩群細(xì)胞的一個(gè)原因，接受抗原刺激的γδT細(xì)胞分化為IFN-γ+細(xì)胞，而未接受刺激的分化為IL-17+細(xì)胞.[4]本文利用HBs-Tg和HBs-Tg與γδT細(xì)胞缺陷型(TCRδ-/-)小鼠雜交篩選出的HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠，腹腔連續(xù)注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型，以探討γδT細(xì)胞在HBs-Tg轉(zhuǎn)基因小鼠肝纖維化模型中的作用.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J(WT)、C57BL/6J-TgN(AlblHBV)44Bri transgenic(HBs-Tg)、HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，飼養(yǎng)于南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房.

1.2 主要試劑

無(wú)水CCl4購(gòu)于SIGMA-ALDRICH公司(貨號(hào)：289116)；橄欖油(olive oil)購(gòu)于上海生工生物工程有限公司(貨號(hào)：A502795-0100)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(賴氏法)購(gòu)于上海榮盛生物技術(shù)有限公司；TRIzol Reagent購(gòu)于Invitrogen公司(貨號(hào)：15596018)；cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號(hào)：RR037A)、RealMasterMix(SYBR Green，貨號(hào)：RR820A)試劑盒購(gòu)于Takara公司.

1.3 動(dòng)物模型建立

[5]中的方法建立肝纖維化模型：將雄性WT小鼠隨機(jī)分組，每組10只，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射體積分?jǐn)?shù)25%的CCl4油劑溶液(0.05 mL/kg)，對(duì)照組按同樣方法注射等劑量的橄欖油，每周2次，連續(xù)8周.將雄性WT，HBs-Tg，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠隨機(jī)分組，每組5只，注射體積分?jǐn)?shù)25%的CCl4油劑溶液(0.05 mL/kg)，每周2次，連續(xù)8周.[5]通過測(cè)量血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)含量及肝臟外觀變化等確定肝纖維化模型是否造模成功.

1.4 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量測(cè)定

在CCl4造模后第2，4，6，8周，每只小鼠依次眼靜脈取血，取血后室溫靜置2 h，5 000 r/min離心8 min，提取血清樣品.按試劑盒說(shuō)明書操作(賴氏法)檢測(cè)血清中ALT含量.

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

在CCl4造模后第8周，眼靜脈放血后處死小鼠，留取肝臟組織.利用TRIzol法提取肝臟組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后使用SYBR Green熒光染料定量檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)水平.內(nèi)參基因選取GAPDH，反應(yīng)溫度為95℃，3 min預(yù)變性后，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)反應(yīng)包括：95℃，15 s；60℃，30 s.隨后95℃，15 s；60℃，15 s；60℃～95℃緩慢升溫25 min產(chǎn)生融解曲線.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad PRISM 5.0 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.兩組間差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)，三組及以上組間差異顯著性分析采用One-way ANOVA分析.*表示P<0.05，有顯著性差異；**表示P<0.01，有極顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1 WT小鼠肝纖維化模型構(gòu)建

2.1.1 WT小鼠肝纖維化造模后血清中ALT動(dòng)態(tài)變化

為檢測(cè)CCl4肝纖維化造模后小鼠肝損傷水平，我們首先檢測(cè)小鼠血清中ALT水平的變化.如圖1所示，腹腔注射CCl4造模6周和8周后，隨造模時(shí)間推移，ALT水平也隨之升高.實(shí)驗(yàn)組(CCl4組)6周、8周ALT水平高于對(duì)照組(橄欖油組)，且均有顯著性差異.實(shí)驗(yàn)組ALT水平為對(duì)照組的2倍左右，表明實(shí)驗(yàn)組(CCl4組)肝損傷(纖維化)水平更為嚴(yán)重.

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖1 WT小鼠肝纖維化造模后血清中ALT的變化

圖2 WT小鼠肝纖維化造模后肝臟外觀變化

2.1.2 WT小鼠肝纖維化造模后肝臟外觀變化

如圖2所示，腹腔注射CCl4造模6～8周后，實(shí)驗(yàn)組(CCl4組)小鼠肝臟表面粗糙不平，有大小不等的結(jié)節(jié)，凹凸不平，質(zhì)硬，韌性大;而對(duì)照組(橄欖油組)小鼠肝臟表面光滑平整，呈暗紅色，質(zhì)地軟，邊緣銳利.結(jié)果表明四氯化碳(CCl4)建造肝纖維化模型基本成功.

2.2 HBs-Tg小鼠的γδT細(xì)胞在肝纖維化模型中的作用

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖3 WT，HBs-Tg，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝纖維化造模后血清中ALT的變化

為進(jìn)一步探討HBs-Tg小鼠的γδT細(xì)胞在肝纖維化模型中的作用，選取WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠，連續(xù)8周腹腔注射CCl4建立肝纖維化模型.分別在2，4，6，8周檢測(cè)這3種小鼠血清中的ALT水平.結(jié)果(見圖3)顯示，HBs-Tg小鼠血清中ALT水平高于WT小鼠，且兩組間有顯著性差異，表明與WT小鼠相比，HBs-Tg小鼠肝損傷(纖維化)更為嚴(yán)重；而HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠血清中ALT水平高于HBs-Tg小鼠，兩者間也具有顯著性差異，表明與HBs-Tg小鼠相比，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝損傷(纖維化)更為嚴(yán)重，而HBs-Tg小鼠的γδT細(xì)胞在肝纖維化過程中可能起到了保護(hù)作用.

2.3 WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝組織中肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)情況

根據(jù)2.1和2.2的結(jié)果，CCl4造模8周后小鼠肝纖維化已基本形成，且ALT水平有顯著性差異，因此選取CCl4造模8周這一時(shí)間點(diǎn)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝組織中肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4.由圖4可見，與WT小鼠相比，HBs-Tg小鼠肝臟α-SMA，TIMP1，Col1a1基因高表達(dá)，且兩者具有顯著性差異；而HBs-Tg-TCRδ-/小鼠肝臟α-SMA，TIMP1，Col1a1基因表達(dá)水平顯著高于HBs-Tg小鼠.α-SMA，TIMP1，Col1a1基因表達(dá)水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明HBs-Tg小鼠的γδT細(xì)胞在肝纖維化過程中起到了保護(hù)的作用.

圖4 WT，HBs-Tg和HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠肝組織中肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)情況

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損害所致的病理改變，各種病因所致反復(fù)或持續(xù)的慢性肝實(shí)質(zhì)炎癥或壞死可導(dǎo)致肝臟持續(xù)不斷的纖維增生而形成肝纖維化.肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前國(guó)內(nèi)引起肝纖維化的病因以乙型病毒性肝炎最為常見，而國(guó)外以慢性酒精性肝病最為常見.本項(xiàng)研究中選取的CCl4是一種選擇性肝毒性物質(zhì)，是經(jīng)典的肝纖維化誘導(dǎo)劑.CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型與人類的肝纖維化病理過程相似，同時(shí)還具有簡(jiǎn)單易行、耗時(shí)短、成模率高、具有明顯的肝纖維化分期過程、停止給藥后有自然恢復(fù)趨勢(shì)等特點(diǎn).[6]本項(xiàng)研究首先利用WT小鼠應(yīng)用CCl4構(gòu)建肝纖維化模型，通過血清ALT和肝臟外觀變化可證實(shí)肝纖維化造?；境晒?

在臨床研究中，乙型肝炎病毒(HBV)感染會(huì)發(fā)展為肝纖維化，但是這一過程中的具體免疫應(yīng)答機(jī)制不是很清楚，特別是HBV攜帶狀態(tài)下.本項(xiàng)研究選用的HBs-Tg小鼠，其過表達(dá)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，盡管在肝細(xì)胞或血清中能檢測(cè)到HBsAg，但是卻沒有肝功能異常和病理?yè)p傷，小鼠形成免疫耐受，模擬HBV感染后的病毒攜帶狀態(tài).[7]近年來(lái)多種HBV 攜帶轉(zhuǎn)基因小鼠的制成對(duì)研究HBV 誘導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷機(jī)制和新藥物開發(fā)提供了新的手段.為探究γδT細(xì)胞在HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠肝纖維化模型中的作用，利用WT，HBs-Tg，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠構(gòu)建肝纖維化模型后，HBs-Tg-TCRδ-/-小鼠反映肝損傷程度的血清ALT水平，反映肝纖維化程度的肝臟組織α-SMA，TIMP1，Col1a1基因表達(dá)水平均顯著高于HBs-Tg小鼠，結(jié)果提示HBs-Tg小鼠的γδT細(xì)胞在肝纖維化過程中起到了保護(hù)作用.

γδT細(xì)胞作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在很多疾病過程中均發(fā)揮著重要作用.在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)疾病模型中，Vγ4 γδT細(xì)胞產(chǎn)生的白介素17(IL-17A)可促進(jìn)CIA的疾病進(jìn)程[8]；同時(shí)在李斯特菌感染過程中，γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17A可以抵抗感染過程[9].組織分布的特異性、周圍微環(huán)境、抗原受體的結(jié)構(gòu)等均可以影響γδT細(xì)胞發(fā)揮不同的功能[10].肝臟是人體的一種特殊器官，既負(fù)責(zé)清除體內(nèi)毒素物質(zhì)(過濾器)，同時(shí)又是一種富含大量免疫細(xì)胞的臟器.隨著對(duì)多種肝損傷模型的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)不同刺激誘發(fā)的肝損傷由不同的免疫細(xì)胞介導(dǎo).我們之前的研究結(jié)果表明，γδT細(xì)胞在ConA引起的急性肝損傷中起到了保護(hù)作用，這一過程主要是由γδT細(xì)胞分泌的IL-17A調(diào)控NKT分泌IFN-γ介導(dǎo).[11]肝臟的這些免疫細(xì)胞之間通過細(xì)胞因子、黏附因子及細(xì)胞間相互作用而形成一種獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò).由于肝損傷最終導(dǎo)致肝纖維化甚至肝癌等高風(fēng)險(xiǎn)疾病，因此深入了肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中肝臟免疫細(xì)胞間的相互調(diào)控機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義.本文的研究結(jié)果為今后γδT細(xì)胞對(duì)肝纖維化的治療提供了一個(gè)新的思路和方法.

[參 考 文 獻(xiàn)]

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(責(zé)任編輯：方 林)

The role of γδT cells in CCl4-indecued liver fibrosis
of hepatitis B virus transgenic mice

MENG Zi-yu1，WU Zhen-zhou1，ZHAO Li-qing1

(College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China)

γδT cells is one subset of T cells and serve as a bridge between innate and adaptive immune responses.γδT cells also play regulatory roles in anti-tumor，virus infection and autoimmune diseases.In this study，using HBs-Tg mice crossed with TCRδ-/-mice to obtain HBs-Tg-TCRδ-/-mice，explored the role of γδT cells in CCl4-induced liver fibrosis of HBs-Tg mice.The results demonstrated that ALT，α-SMA，TIMP1，COl1a1 levels of HBs-Tg-TCRδ-/-mice were significantly higher than HBs-Tg mice，and γδT cells of HBs-Tg mice played a protective role in CCl4-induced liver fibrosis.The results provided the foundation for further research of liver fibrosis treatment via γδT cells.

γδT cells；liver fibrosis；HBs-Tg mice

1000-1832(2017)02-0116-04

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.02.022

2016-09-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170858，31370883).

孟子愉(1988—)，女，博士研究生；通訊作者：趙立青(1962—)，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事基礎(chǔ)免疫學(xué)研究.

R 392.1 [學(xué)科代碼] 180·2150

A