慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA的表達及血清IL-1β、IL-18檢測的意義

毛建 宋珊 賈欽堯 陳紹平 韓美玲 廖俊蕾

慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA的表達及血清IL-1β、IL-18檢測的意義

毛建 宋珊 賈欽堯 陳紹平 韓美玲 廖俊蕾

目的 通過對慢阻肺患者外周血淋巴細胞NLRP3 mRNA及血清中炎癥介質IL-1β、IL-18的檢測，探討NLRP3炎癥小體在慢阻肺發病中的作用。方法 選取60例確診AE慢阻肺患者，根據有無呼吸衰竭，分為2組，每組30例，急性加重期患者經治療癥狀體征好轉達到緩解期水平后作為慢阻肺組，同期門診健康體檢者30例作為健康對照組。采用ELISA檢測各個組血清中IL-1β、IL-18的濃度，采用PCR檢測各組中NLRP3 mRNA的表達量。 結果 AECOPD組和慢阻肺緩解組患者的NLRP3 mRNA表達量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于健康對照組(P<0.05); AE慢阻肺組患者的NLRP3 mRNA表達量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于慢阻肺緩解組(P<0.05)；慢阻肺合并呼吸衰竭患者的NLRP3 mRNA表達量和血清中IL-1β和IL-18的濃度顯著高于未合并呼吸衰竭患者(P<0.05)；慢阻肺患者NLRP3 mRNA表達量與血清中IL-1β、IL-18的濃度呈正相關，相關系數r分別為0.69和0.70(P<0.05)；IL-1β的濃度與IL-18的濃度呈正相關，相關系數r=0.65(P<0.05)。結論 NLRP3和IL-1β、IL-18參與慢阻肺的炎癥反應，其濃度升高導致慢阻肺病情嚴重程度增加。

NRLP3 mRNA；慢阻肺；IL-1β；IL-18

NLRP3(NOD-like Receptor Family, Pyrin Domain Containing 3，NLRP3)是10號染色體1q44上的NLRP3基因編碼的蛋白質。NLRP3分子、凋亡相關微粒蛋白(Apoptosis associated speck-like protein containing ASC)以及半胱天冬酶(caspase-1)共同組成的多聚蛋白復合物即為NLRP3炎癥小體[1]。近年研究表明[2]，NLRP3與多種炎癥性疾病密切相關，在炎癥反應的急性期，NLRP3表達量明顯增加，在炎癥反應緩解期時其表達量又顯著下降。但是NLRP3與慢阻肺的相關性研究相對較少，且目前研究結果不一致，尚沒有定論。有研究顯示[3]，IL-1β、IL-18在慢阻肺患者中的水平升高，是引起慢阻肺病情加重的重要因素。因此有必要進一步對NLRP3 mRNA和IL-1β、IL-18進行聯合檢測，探索它們在慢阻肺發生發展中的作用。

資料與方法

一、研究對象

選取2014年10月至2015年5月于川北醫學院附屬醫院住院的60例確診AECOPD患者，其中男性31例，女性29例，年齡70.43±7.92歲。AECOPD組根據有無呼吸衰竭，分為AECOPD合并呼吸衰竭組，其中男性16例，女性14例，年齡70.28±7.85歲。AECOPD未合并呼吸衰竭組，其中男性15例，女性15例，年齡70.76±8.12歲。急性加重期患者經治療癥狀體征好轉達到緩解期水平后作為慢阻肺組，同期門診健康體檢者30例作為健康對照組，其中男女各15例，年齡70.15±7.73歲。所有患者的診斷均符合《2015年GOLD指南》，且近4周無呼吸道感染史，無高血壓、冠心病、心肌病、糖尿病、甲亢等疾病。所有患者均知情同意，各組間一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。

二、主要儀器和試劑

人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物公司，中國)，快速熒光定量PCR預混試劑(天根生化科技有限公司，中國)，實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(TakaRa公司, JAPAN)，Human IL-18 ELISA Kit(欣博盛生物科技有限公司，中國)，Human IL-1βELISA Kit(欣博盛生物科技有限公司，中國)；7900 RT-PCR儀(ABI公司，美國 )，Jaeger Master Screen肺功能檢測儀(耶格公司，德國)，Infinite M2000 Pro多功能酶標儀(TECAN公司，瑞士)。

三、研究方法

1 設計引物

根據gene bank中的NLRP3和人肌動蛋白β-actin序列，由上海生物工程有限公司設計合成PCR引物。NLRP3與β-actin內參引物序列(見表1)。

2 熒光定量PCR檢測NLRP3 mRNA表達 從外周靜脈血中，分離出外周血單個核細胞(PBMCs)，提取總RNA，加30 μL無RNA酶水溶解RNA，逆轉錄合成cDNA，總反應體系20 μL，反應條件：擴增反應為95℃預變性1min；95℃ 5s，60℃ 15s，30次循環；72℃延伸5min。熔解反應為95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s。NLRP3 mRNA表達量計算：ΔCt=NLRP3Ct值-β-actin Ct值；ΔΔCt=實驗組-對照組Ct值。2(-ΔΔCt)值表示NLRP3 mRNA相對表達量。

表1 NLRP3、β-actin基因引物序列及PCR擴增長度

3 檢測血清中IL-1β、IL-18的濃度

采用雙抗體夾心ELISA法，嚴格按照人IL-1β、人IL-18定量ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，中國)說明書步驟檢測各組血清中IL-1β、IL-18的濃度。

四、統計學方法

結 果

一、AECOPD組和慢阻肺緩解組患者的NLRP3 mRNA表達量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于健康對照組(P<0.05); AECOPD組患者的NLRP3 mRNA表達量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于慢阻肺緩解組，P<0.05，(見表2)。

二、慢阻肺組中合并有呼吸衰竭患者的NLRP3 mRNA表達量和血清中IL-1β和IL-18的濃度顯著高于未合并呼吸衰竭患者，P<0.05，(見表3)。

三、慢阻肺患者NLRP3 mRNA表達量與血清中IL-1β、IL-18濃度呈正相關，NLRP3與 IL-1β相關系數0.69(P<0.05)；NLRP3與IL-18相關系數0.70(P<0.05)；IL-1β與IL-18相關系數0.65(P<0.05)。

表2 AECOPD組、慢阻肺緩解組與健康對照組NLRP3 mRNA相對表達量和血清IL-1β、IL-18濃度

注：與AECOPD組比較，aP<0.05；與慢阻肺緩解組比較，bP<0.05。

表3 AECOPD亞組和健康對照組NLRP3 mRNA相對表達量和血清IL-1β、IL-18濃度

注：與AECOPD組比較，aP<0.05；與慢阻肺緩解組比較，bP<0.05。

討 論

NLRP3炎癥小體是固有免疫系統的重要組成部分，內源性和外源性的多種危險信號均可激活NLRP3炎癥小體，其活化后形成的多蛋白復合體可激活半胱天冬酶(caspase-1)，進一步加工IL-1β和IL-18的前體，形成并分泌IL-1β、IL-18等前炎癥介質，激活下游一系列炎癥反應[4-5]。IL-1β、IL-18屬于IL-1家族，由單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等多種細胞分泌。L-1β可激活T淋巴細胞啟動適應性免疫應答，招募炎癥細胞至感染部位，引發炎癥反應和組織損傷。IL-18最初從小鼠肝臟提取液中分離得到，被命名為INF-γ誘導因子[6]。近年研究發現[7]，香煙煙霧暴露、感染及吸入有害氣體等可能通過共同的NLRP3炎癥小體信號通路引起肺部及全身炎癥反應，加快慢阻肺病情發展。

本研究結果顯示：AECOPD組和慢阻肺緩解組中患者的NLRP3 mRNA表達量和IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于健康對照組(P<0.05)，AECOPD組患者的NLRP3 mRNA表達量和IL-1β和IL-18的濃度明顯高于慢阻肺緩解組，差異有統計學意義(P<0.05)。推測NLRP3 mRNA表達水平在AECOPD組與慢阻肺緩解組之間的差異與病原微生物感染因素相關。感染是臨床上引起慢阻肺急性加重最常見的誘因，感染引起慢阻肺患者病情急性加重時，病原微生物通過PAMPs刺激巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞，引起NLRP3 mRNA表達增加。經過抗感染治療使癥狀緩解后，病原微生物數量下降，PAMPs減少，NLRP3 mRNA表達量亦隨之下降。但是肺部持續性的炎癥反應，引起炎癥小體持續性活化，導致IL-1β、IL-18濃度進一步上升，通過促進下游炎癥反應，加重患者的臨床癥狀和肺組織的損傷，促進慢阻肺病情惡化和疾病進展[6,8]。

此外，AECOPD合并呼吸衰竭組患者的NLRP3 mRNA表達量和IL-1β和IL-18的濃度顯著高于AECOPD未合并呼吸衰竭組，差異有統計學意義(P<0.05)。由于合并呼吸衰竭的患者多為長期反復住院者或體質差免疫功能低下者，因此推測廣譜抗生素的長期使用、免疫功能低下等因素容易引起呼吸道病原微生物的定植以及二重感染的發生，可通過多種PAMAs活化更多的NLRP3炎癥小體，造成這些患者肺部感染更重，進一步證實NLRP3炎癥小體在慢阻肺的發生發展過程中具有重要作用，同時也說明IL-1β、IL-18濃度升高不僅促進肺部炎癥反應，而且與病情嚴重程度相關，IL-1β、IL-18濃度升高，患者的癥狀也隨之加重[8-9]。本研究還發現NLRP3 mRNA表達水平與IL-1β、IL-18表達水平呈正相關性，差異有統計學意義(P<0.05)。這與Rotta[10]等的研究結果一致。病原微生物感染、香煙煙霧暴露、吸入粉塵及有害氣體等多種危險因素可通過PAMPs和DAMPs途徑活化NLRP3炎癥小體，進一步促進下游IL-1β、IL-18等炎癥介質的成熟與釋放，共同參與慢阻肺病情的進展。本研究結果進一步支持NLRP3和IL-1β、IL-18可能在同一信號通路上。

綜上所述，NLRP3在慢阻肺的發病過程中具有重要作用，NLRP3的表達水平可能作為臨床上評價慢阻肺病情的有價值指標之一，進一步研究NLRP3 炎癥小體在慢阻肺中的作用，能夠對慢阻肺的新藥開發及臨床治療等提供新的思路。

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Significance of peripheral blood lymphocyte NLRP3 mRNA expression and IL-1β and IL-18 detection in COPD patients

MAOJian,SONGShan,JIAQin-yao,CHENShao-ping,HANMei-ling,LIAOJun-lei

DepartmentofRespiratoryMedicine,theAffiliatedHospitalofChuanbeiMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China

Objective To explore the role of NLRP3 inflammasome in the occurrence and development of COPD through the detection of NLRP3 mRNA in peripheral blood lymphocyte and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of COPD patients. Methods 60 patients with AECOPD were selected and divided into 2 groups according to whether there was no respiratory failure, 30 cases in each group. Patients with acute exacerbation of symptoms and signs after improvement to achieve remission level were taken as the COPD group, and 30 cases of healthy people at the same period were selected as the control group. The concentration of IL-1β and IL-18 was measured by ELISA method and the expression of NLRP3 mRNA was measured by qRT-PCR. Results The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of patients with AECOPD or stable COPD was significantly higher than that of the control group (P<0.05). The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of the AECOPD group was obviously higher than that of the stable COPD group (P<0.05). The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of the respiratory failure group was notably higher than that of the without respiratory failure group (P<0.05). The correlation was positive between the level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18, and the correlation coefficient r equal to 0.69 and 0.70, respectively (P<0.05). The correlation was positive between the concentration of IL-1β and IL-18 (r=0.65,P<0.05). Conclusion NLRP3 and IL-1β, IL-18 involve in the inflammatory reaction of COPD, and the increase of the concentration can cause a serious increase in the severity of the disease.

NRLP3 mRNA; COPD; IL-1β; IL-18

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.026

四川省教育廳基金項目支持(No 16ZB023)

637000 四川 南充，川北醫學院附屬醫院呼吸內科

陳紹平，E-mail：chenshaoping836@163.com

2016-10-24]