內質網應激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬組織中的表達及β—細辛醚的干預作用

耿道明　金銘　楊盼盼　李成沖　董海影　趙阿勐　張曉杰　蔡珍珍

【摘要】 目的：探討內質網應激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬組織中的表達及β-細辛醚的干預作用。方法：將100只SD大鼠隨機分為5組（正常對照組、模型組、氟西汀組、β-細辛醚低劑量組和高劑量組），每組20只。孤養結合慢性不可預見性刺激，模型復制成功后第2天給予氟西汀組和β-細辛醚組1次/d灌胃，給藥劑量分別為氟西汀10 mg/（kg·d）、β-細辛醚25 mg/（kg·d）、β-細辛醚50 mg/（kg·d）。于實驗前和實驗第29天，對大鼠進行行為學測量，采用免疫組織化學檢測法檢測PERK蛋白水平。結果：經28 d慢性不可預見性溫和刺激（CUMS）后，模型組大鼠水平運動和垂直運動得分均明顯低于正常對照組（P<0.05）；β-細辛醚低劑量和高劑量組與氟西汀組大鼠水平和垂直運動得分均明顯高于模型組（P<0.05）。模型組大鼠海馬區PERK蛋白表達明顯高于正常對照組（P<0.05），β-細辛醚低、高劑量組與氟西汀組大鼠海馬區PERK蛋白表達均明顯低于模型組（P<0.05）。結論：β-細辛醚可以改善大鼠抑郁行為，其機制可能與降低大鼠海馬組織中PERK蛋白表達有一定關聯。

【關鍵詞】 內質網； 應激； 抑郁； 大鼠

Expression of Endoplasmic Reticulum Stress-regulating Factor PERK in Hippocampus of Depressive Rats and Intervention of β-asarone/GENG Dao-ming，JIN Ming，YANG Pan-pan，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（15）：004-007

【Abstract】 Objective：To study the expression of endoplasmic reticulum stress regulators PERK in hippocampus of depressive rats and the intervention effect of β-asarone.Method：120 SD rats were randomly divided into 5 group（normal control group，model group，Fluoxetine group，β-asarone low dose group，β-asarone high dose group，20 rats in each group.Solitary feeding combined with chronic unforeseen mild stimuli（CUMS），and then on the 2nd day after the model establishment，rats in Fluoxetine group and β-asarone group were treated with Fluoxetine[10 mg/（kg·d）]，β-asarone [25 mg/（kg·d），50 mg/（kg·d）] once daily by intragastric administration.Behavioral measurements were made before and the twenty-ninth days after the experiment and the level of PERK protein was detected by immunohistochemistry.Result：After CUMS for 28 days，the scores of horizontal motion and vertical motion in model group were lower than those in normal control group （P<0.05），the levels of vertical and horizontal movements in the β-asarone low dose and high dose group and Fluoxetine group were significantly higher than that in the model group （P<0.05）.The expression of PERK protein in hippocampus of model group was significantly higher than that in normal control group （P<0.05），the expression of PERK protein in the hippocampus of rats in the β-asarone low， high dose group and Fluoxetine group were significantly lower than that in the model group （P<0.05）.Conclusion：β-asarone could alleviate the symptoms of depression in rats effectively，its mechanism might be related to decreasing the protein expression of PERK in the rat hippocampus.

【Key words】 Endoplasmic reticulum； Stress； Depression； Rat

First-authors address：Qiqihaer Medical College，Qiqihaer 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.15.002

抑郁癥的發病率呈現逐年增加的趨勢，其病因較為復雜，病程較長，嚴重影響個人及家庭的生活質量[1]。近年來研究發現，內質網應激在神經系統疾病發生、發展中的作用也開始逐漸被關注，關于內質網應激可以引起神經元的凋亡已經在許多神經退行性疾病的發病機制研究中得到證實[2]，另有數據證實內質網應激亦是自噬的誘導因素[3-4]，自噬平衡內質網應激誘導的內質網膨脹，維持細胞存活，也可以調節大鼠抑郁癥狀。本實驗主要從內質網應激角度，探討內質網應激因子PERK在抑郁模型大鼠海馬組織中的表達。

1 材料與方法

1.1 動物及藥品 （1）動物：清潔級SD大鼠，2～3月齡，體重180～200 g，哈爾濱醫科大學實驗動物醫學部，許可證號SCXK（黑）2013-0001。（2）藥品及試劑：β-細辛醚標準品（天津一方科技有限公司，批號00011017-T9K），鹽酸氟西汀膠囊（蘇州俞氏藥業有限公司，批號100201），蛋白激酶R樣內質網激酶PERK抗體（美國Cell Signaling公司，批號為#9451），山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG（北京康為世紀生物科技有限公司，批號分別為CW0103、CW0105）。

1.2 儀器 CX31R BSF型光學顯微鏡（Olympus），DP801型圖像分析系統（Alphamiager公司），DK-8D型電熱恒溫水浴箱（上海合恒儀器設備有限公司），THZ-82型恒溫振蕩器（江蘇太倉醫療器械廠），AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），METTLER TOLEDO 型PH測試儀（上海秋騰貿易有限公司），79-1型磁力加熱攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 造模及給藥 大鼠適應性喂養1周后，隨機分為5組，每組20只大鼠。正常對照組不給予任何刺激和藥物；模型組給予生理鹽水灌胃；氟西汀組給予鹽酸氟西汀10 mg/（kg·d）；β-細辛醚低劑量組給予β-細辛醚25 mg/（kg·d）灌胃；β-細辛醚高劑量組給予β-細辛醚50 mg/（kg·d）灌胃。對照組大鼠每5只一籠飼養，自由飲食飲水。其他各組大鼠單籠孤養，采用慢性不可預見性刺激處理[5]，持續28 d，每種應激方式使用不超過3次，避免大鼠耐受。具體應急方式為：禁食水24 h、熱刺激5 min（45 ℃）、夾尾3 min、強迫冰水游泳10 min（4 ℃）、鼠籠傾斜24 h（45°）、束縛24 h、潮濕環境24 h、聲音刺激12 h（120 dB）、晝夜顛倒、搖晃1 h、閃光燈照射12 h、通宵擁擠。除對照組外其余各組大鼠從造模開始后第8天開始給予生理鹽水或相應藥物，1次/d，共28 d。

1.3.2 行為學評價 在實驗前和實驗第29天進行曠場實驗（Open-field-test）觀察各組大鼠行為學變化。實驗用敞箱為無蓋方箱，高40 cm，長寬均為125 cm，箱內四壁涂成黑色，底板白色，底板用黑線劃成25個25 cm×25 cm的等邊方格。實驗進行時環境安靜，敞箱周圍參照物不變。將單只大鼠輕放于敞箱底板正中心的方格內，記錄大鼠3 min內動作行為表現包括水平穿越格數、直立次數。以大鼠的四肢完全進入一個方格區域作為水平運動的1分，以雙前肢完全抬離地面作為直立次數的1分。每只大鼠單獨測試，每檢測完一只大鼠后用75%乙醇徹底清潔敞箱并干燥后再進行下一只大鼠的檢測。

1.3.3 免疫組織化學法檢測大鼠海馬組織PERK蛋白表達 取石蠟包埋的大鼠海馬組織，于相應部位進行連續切片各5張，脫蠟和水化后進行抗原修復。采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（SP）法進行免疫組織化學染色，并DAB顯色，經過蘇木素復染、PBS洗滌、鹽酸乙醇分化后返藍，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每一張切片在陽性表達區域挑選10個無重疊視野，使用Olympus顯微鏡、DP801形態分析軟件進行圖像采集處理，測出PERK蛋白抗原表達總面積、陽性細胞數和平均吸光度A，計算積分吸光度（IA）。

1.4 統計學處理 運用SPSS 22.0軟件包，計量資料用（x±s）表示，比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評價結果比較 實驗開始前1 d進行曠場實驗，各組大鼠水平運動和垂直運動得分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。經28 d慢性不可預見性溫和刺激后，與正常對照組比較，模型組大鼠水平運動和垂直運動得分均明顯減少（P<0.05）；與模型組比較，氟西汀組、β-細辛醚低劑量和高劑量組大鼠水平和垂直運動得分均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 大鼠海馬組織PERK蛋白表達 模型組大鼠海馬區PERK蛋白表達明顯高于正常對照組，通過圖像分析成像系統分析測得PERK積分光密度值為（24.56±1.25），較正常對照組的（8.33±1.01）高，差異有統計學意義（P<0.05）。氟西汀組與β-細辛醚低、高劑量組大鼠海馬區PERK蛋白表達分別為（10.30±1.75）、（18.72±2.01）、（16.33±1.84），均明顯低于模型組，差異均有統計學意義（P<0.05）。各組蛋白表達見圖1。

3 討論

實驗通過孤養結合CUMS制造大鼠抑郁模型，通過曠場實驗評價實驗受體在新環境中的自主行為、緊張程度，有效評價大鼠抑郁模型復制結果[6-8]。該實驗中模型組大鼠28 d后測得水平運動與垂直運動得分均較正常組降低，大鼠出現明顯的抑郁癥狀，達到預期造模水平。β-細辛醚低、高劑量組與氟西汀組大鼠曠場實驗分數較模型組增加，提示β-細辛醚可以改善大鼠抑郁樣行，這與筆者前期的實驗相吻合[9-11]。

PERK屬于ERS感受器中的一種，內質網應激早期，PERK通過自身磷酸化和二聚化使真核細胞蛋白翻譯起始復合體（eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）的α亞基第51位的絲氨酸Ser發生磷酸化，阻止與葡萄糖羥基轉移酶結合，抑制目標蛋白質的起始翻譯，阻礙蛋白質的合成，降低細胞內的蛋白負荷，減輕ER的負擔[12-14]。細胞激活PERK基因的表達后，胞內的蛋白翻譯作用迅速減少，細胞周期蛋白D1（cyclin D1）急劇減少，使停滯在G1期的細胞大量增加[15]。PERK、ATF6、IRE-1增加的Ca2+也已被證實是ERS誘導自噬的調節者。該實驗中，抑郁模型組大鼠海馬組織中的PERK蛋白高表達，給予β-細辛醚或陽性藥物的動物組，PERK表達降低，提示PERK可以預測大鼠海馬神經元受損程度。石菖蒲作為中醫治療腦病的常用藥物，以其醒神益智、健腦開竅為主要作用。根莖中主要成分是揮發油，包含α-細辛醚和β-細辛醚[16]。

近10年研究發現，內質網應激是區別于線粒體途徑且能導致細胞凋亡的一條新的通路，內質網應激目前在胰腺、神經元、肝臟等細胞發病機制中研究熱門[17]，在抑郁發生、進展過程中的作用尚未明確，筆者前期對抑郁模型大鼠行為及其海馬神經元轉歸做了大量實驗研究[18-20]，已證實β-細辛醚對抑郁大鼠模型有較明確的治療作用，目前主要針對內質網應激調節抑郁模型大鼠相關因子的研究，此方面還需要進一步探討及大數據的支持，筆者下一步將對內質網應激調節通路進一步探索。

參考文獻

[1]奚耕思，張武會.抑郁癥發生機制研究進展[J].陜西師范大學學報：自然科學版，2011，39（6）：64.

[2] Yan F，Li J，Chen J，et al.Endoplasmic reticulum stress is associated with neuroprotection against apoptosis via autophagy activation in a rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Neurosci Lett，2014，563（5）：160-165.

[3] Momoi T.Conformational diseases and ER stress-mediated cell death：apoptotic cell death and autophagic cell death[J].Curr Mol Med，2006，6（1）：111-118.

[4] Gardner B M，Walter P.Unfolded proteins are Ire1-activating ligands that directly induce the unfolded proteins response[J].Science，2011，333（6051）：1891-1894.

[5]郭曉云，江開達.慢性輕度應激抑郁癥動物模型研究進展[J].國際精神病學雜志，2007，34（4）：216.

[6]董海影，興桂華，張曉杰.不同年齡組大鼠抑郁模型評價[J].中國老年學雜志，2011，31（6）：1796.

[7] Wester J C，Contreras D. Differential Modulation of Spontaneous and Evoked Thalamocortical Network Activity by Acetylcholine Level in Vitro[J].The Journal of Neuroscience，2013，33（45）：17 951.

[8] Vera Geraldes，Nataniel Goncalves-Rosa，Beihui Liu，et al.

Chronic depression of hypothalamic paraventricular neuronal activity produces sustained hypotension in hypertensive rats[J].Expreimental Physiology，2014，99（4）：89.

[9]孫玉榮，董海影，王顯艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠行為及海馬神經元的影響[J].北京中醫藥大學學報，2013，36（8）：546-549.

[10] Jingyan ZHANG，Zhenzhen CAI，Guangyou XU，et al.

Influence of Saikosaponin on Behavior and Hippocampal Neurons in Rat Depression Models[J].Latin American Journal of Pharmacy，2015，34（9）：1830-1835.

[11]榮華，董海影，張靜艷，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬CA3區超微改變及腦組織ERK蛋白表達的影響[J].中國醫學創新，2013，10（36）：10-12.

[12] Momoi T.Conformational diseases and ER stress-mediated cell death： apoptotic cell death and autophagic cell death [J].Curr Mol Med，2006，6（1）：111-118.

[13] Brostrom C O，Brostrom M A.Regulation of translational initiation during cellular responses to stress[J].Progress in Nucleic Acid Research & Molecular Biology，1998，58（58）：79.

[14] Korsmeyer S J，Shutter J R，Veis D J，et al.Bcl-2/Bax：a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death[J].Seminars in Cancer Biology，1993，4（6）：327-332.

[15] Schewe D M，Aguirre-Ghiso J A.ATF6α-Rheb-mTOR signaling promotes survival of dormant tumor cells in vivo[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（30）：10 519-10 524.

[16]魏立平，吳玫涵.用氣相色譜法同時測定石菖蒲揮發油中α-細辛醚和β-細辛醚的含量[J].解放軍藥學學報，2005，21（1）：62.

[17]張凱強，張穎，顧何鋒，等.內質網應激與細胞凋亡研究進展[J].口腔醫學，2013，33（6）：415-417.

[18]金銘，蔡珍珍，劉得水，等.β-細辛醚改變抑郁模型大鼠行為及對海馬MEK-ERK級聯通路的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（18）：113-118.

[19]金銘，蔡珍珍，董海影，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠海馬組織及Bax、Bcl-2的影響[J].中國醫學創新，2014，11（18）：36-38.

[20]趙春明，張曉杰，董海影，等.β-細辛醚對抑郁模型大鼠行為及海馬MKP-1，MSK-1，CREB和Bcl-2的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（16）：272.

（收稿日期：2017-04-05） （本文編輯：張爽）