鐵皮石斛多倍體誘導研究

馬仲強 劉太林 施梅 付璐璐 張雨琦

摘要[目的]研究鐵皮石斛的多倍體誘導。[方法]以鐵皮石斛蒴果為材料，誘導萌發出鐵皮石斛圓球莖，研究不同濃度的NAA、6-BA對鐵皮石斛圓球莖增殖的影響；以秋水仙素作為誘導劑，研究不同濃度秋水仙素、處理時間對多倍體鐵皮石斛誘導的影響。[結果]NAA濃度為1.5 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L時，鐵皮石斛圓球莖增殖效果最好；秋水仙素濃度越低、處理時間越短時，成活率越高、誘導率相對較低；隨著秋水仙素濃度增大，處理時間延長，誘導率升高，但死亡率增大。[結論]秋水仙素濃度在0.15%、處理時間為48 h時，成活率達40%，誘導率為30%，效果最好。

關鍵詞鐵皮石斛；秋水仙素；多倍體；組織培養

中圖分類號S567.23文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）21-0135-03

Study on Polyploid Induction of Dendrobium officinale

MA Zhongqiang，LIU Tailin*，SHI Mei et al

（Tianjin Tianshi College， Tianjin 301700 ）

Abstract[Objective] The research aimed to study the polyploid induction of Dendrobium officinale.[Method]Dendrobium officinale capsule were used as materials to induce round bulb，the effects of different concentrations of NAA and 6BA on the proliferation of round bulbs of Dendrobium officinale were studied.The effects of different concentrations of colchicines and treatment time on the induction of polyploid Dendrobium officinale were studied by using colchicine as an inducer.[Result]When the concentration of NAA was 1.5 mg/L， the concentration of 6BA was 2.0 mg/L， the effect of the proliferation of round bulbs of Dendrobium officinale was the best.The colchicine concentration was lower， treatment time was shorter， the survival rate was higher， the induction rate was relatively low；with the increase of colchicine concentration and treatment time prolonged， the induction rate increased， but increased mortality.[Conclusion] When the concentration of colchicine was 015% and the treatment time was 48 h， the survival rate was up to 40%， and the induction rate was the best， which was 30%.

Key wordsDendrobium officinale；Colchicine；Polyploid；Tissue culture

鐵皮石斛 （Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是國家重點保護藥用植物[1]，多附生于海拔500～1 600 m林中石上或樹上，喜溫暖濕潤氣候，好半陰半陽環境，不耐寒，但有報道其在-5 ℃的低溫下仍能存活[2]。鐵皮石斛含有石斛堿、石斛多糖、蛋白質、17種氨基酸和7種無機元素[2-3]，具有益胃生津、潤肺止咳、滋陰清熱、養陰生津、潤喉護嗓、溫胃明目、補腎益力、延年益壽等功效，可增強免疫力、提高抵抗力、消除腫瘤、抑制癌癥，對白內障、關節炎、胃腸道疾病、慢性咽炎及血栓閉塞性脈管炎等疾病有很好的治療效果[1-4]。石斛屬植物主要集中生長在亞洲熱帶、亞熱帶和大洋洲等地區，我國藥用石斛主要分布于安徽、江西、浙江、福建、四川、廣西和云南等地，其中以云南的產量最大。

鐵皮石斛對自然的生長條件要求十分苛刻，自然產量極為稀少，而傳統的扦插和分株等人工繁殖方式速度慢、效率低，隨著其藥用價值逐漸被消費者熟知和認可，市場日益擴大，過量采集加上生態環境的破壞導致了野生資源瀕臨枯竭[5]。為了滿足日益增大的市場量需求，用多倍體誘導的方法來增大鐵皮石斛的產量[6-8]，提高活性成分的含量，以期為農業生產提供優質的種質資源。筆者以鐵皮石斛蒴果為材料，誘導萌發出鐵皮石斛圓球莖，探討不同濃度的NAA、6-BA對鐵皮石斛圓球莖增殖的影響；以秋水仙素作為誘導劑，研究不同濃度秋水仙素、處理時間對多倍體鐵皮石斛誘導的影響。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

未萌發的鐵皮石斛蒴果購于樂清海上名山鐵皮石斛基地，部分鐵皮石斛組培苗由生物與食品工程學院提供；MS培養基及相關激素NAA、6-BA購于上海藍季科技發展有限公司；秋水仙素購于東洋紡生物科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1無菌體系的建立。

打開超凈工作臺，紫外滅菌30 min，用酒精棉球將超凈工作臺擦拭干凈，然后開始進行無菌體系的建立。

即用流水將鐵皮石斛蒴果表面沖洗干凈，沖洗3～5 min；

將沖洗干凈的鐵皮石斛蒴果放在0.1%氯化汞溶液中浸泡大約15 min；

然后放在75%乙醇中消毒30 s；

取出消毒完的蒴果用無菌水沖洗4～5遍，用滅菌的濾紙吸干表面水分，放置于滅菌的培養皿中；

用刀片將鐵皮石斛蒴果切開，均勻地播種于種子萌發的培養基中。

1.2.2種子的萌發培育。

根據參考文獻[9]得知，選用1/2MS培養基，加入0.2 mg/L NAA，圓球莖增殖效果最好，根據以上數據配置鐵皮石斛種子萌發培育的培養基，將購買的鐵皮石斛蒴果接種于培養基上，獲得鐵皮石斛圓球莖（圖1）用于后續試驗。

1.2.3鐵皮石斛圓球莖的增殖培養。選用MS培養基，加入不同濃度的NAA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L）；選取直徑為0.5～1.0 cm的圓球莖接種到上述培養基中進行增殖培養。

1.2.4鐵皮石斛圓球莖的誘導處理。取出大約8 mL的秋水仙素放入15 mL離心管中，滅菌；取出滅菌的秋水仙素冷卻至室溫，用滅菌的去離子水將其稀釋成不同濃度的秋水仙素溶液（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）；將選取的鐵皮石斛

圓球莖放入上述不同濃度秋水仙素溶液的離心管中，秋水仙素處理鐵皮石斛到達不同時間（12、24、36、48、60 h）后，倒出秋水仙素，用無菌水沖洗3～5次；將無菌水沖洗完的圓球莖放入滅菌培養皿中，用滅菌的濾紙吸干多余水分；最后將處理完的鐵皮石斛圓球莖接種到培養基中[6-8]。

1.2.5多倍體植株的鑒定。

1.2.5.1

材料前處理。取分生組織較強的部位，如根尖、愈傷組織等，取根尖大約0.5 cm左右，置于秋水仙素、8-羥基喹啉或對二氯苯等溶液中低溫處理一定的時間。

1.2.5.2植株鑒定。

用卡諾式固定液固定30 min以上，

用蒸餾水浸泡沖洗20 min以上（注意換水）。

用纖維素酶和果膠酶各2.5%的混合酶酶解30 min，

洗去材料表面殘留的酶液。

用1 mol/L HCL在60 ℃水浴中解離10 min。

最后用改良品紅溶液染色5～10 min，壓片，鏡檢[10]。

2結果與分析

2.1不同濃度NAA、6-BA對鐵皮石斛圓球莖繼代培養的影響

從表1可以看出，當NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度增加，增殖強度逐漸增大，而后減小，當NAA濃度達2.5 mg/L時，增殖強度普遍較低，6-BA濃度在1.5、20 mg/L時，增殖強度較高，當6-BA濃度達2.0 mg/L以上時，增殖強度明顯過低。

當6-BA濃度一定時，隨著NAA濃度的增大，增殖強度逐漸增大，而后減小，但效果不明顯，NAA濃度在1.0、1.5、20 mg/L時，增殖強度相對較好；NAA濃度在0.5、2.5 mg/L時，增殖強度較差。

由以上數據可以得出，細胞生長素與細胞分裂素在不同

比例時，鐵皮石斛圓球莖增殖效果不同，當NAA濃度為1.5 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L，45 d時增殖率高達80%，增殖效果最好。

2.2不同濃度的秋水仙素及處理時間對鐵皮石斛誘導的影響

從表2可以看出，秋水仙素濃度越低、處理時間越短時，成活率越高、誘導率相對較低；隨著秋水仙素濃度增大，處理時間延長，誘導率升高，但死亡率增大。當秋水仙素濃度在一定時，處理時間在24 h以下時，成活率基本在70%以上；

當處理時間在60 h以上時，成活率基本低于50%；當處理時

間在24～48 h時，誘導率基本在20%～30%，成活率相對較高，效果較好，隨著秋水仙素濃度的增加，當秋水仙素濃度達0.15%、0.20%時，誘導率較高，高達30%。

根據綜合情況考量，秋水仙素濃度為0.15%、處理時間為48 h時，成活率達40%，誘導率達30%，效果最好。

2.3多倍體植株的鑒定通過植物顯微技術，觀察得到的鐵皮石斛圓球莖如圖2～4。誘導處理過的鐵皮石斛圓球莖多為二倍體與四倍體混合形成的，為嵌合體。培育形成的多倍體鐵皮石斛具有較好的抗逆性、較高的適應性。

3結論與討論

秋水仙素濃度越低，處理時間越短時，成活率越高、誘導率相對較低；隨著秋水仙素濃度增大，處理時間延長，誘導率升高，但死亡率增大。綜合考量，秋水仙素濃度在0.15%、處理時間為48 h時，成活率達40%，誘導率為30%，效果最好。當NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度增加，增殖強度逐漸增大，而后減小；當6-BA濃度一定時，隨著NAA濃度的增大，增殖強度逐漸增大，而后減小。綜合考量，NAA濃度為1.5 mg/L、6-BA濃度為2.0 mg/L時，鐵皮石斛圓球莖增殖效果最好。

誘導處理過的鐵皮石斛圓球莖多為二倍體與四倍體混合形成的，為嵌合體，后期應以嵌合體圓球莖培育出來的幼

苗，用根尖觀察鑒定，進一步確定形成的多倍體鐵皮石斛數量。

培育形成的多倍體鐵皮石斛具有較好的抗逆性、較高的適應性，將培育好的鐵皮石斛圓球莖培育成幼苗，成長成植株，可以通過氣孔觀察、葉片厚實程度、有效成分含量來進一步驗證多倍體鐵皮石斛在原有基礎上的優勢。

參考文獻

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安徽農業科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（21）：146-150